魔芋甘露聚糖肽的分离纯化及抗肿瘤活性研究

摘要

甘露聚糖肽(Mannatide)是我国首创的一种新型生物反应修饰物和生物免疫增强剂，其作用包括调节机体免疫应答和增强自身抗肿瘤能力。目前，国内临床应用的甘露聚糖肽主要从α-溶血性链球菌培养液中提取，来源单一，因此探索甘露聚糖肽的其它来源和制备方法已成为国内研究的热点。我国是魔芋精粉生产大国，魔芋飞粉作为精粉加工过程中的副产物，产量较大，约占精粉质量的30％～40％。但长期以来，人们对魔芋飞粉的研究应用很少，大部分被直接废弃或当动物饲料使用，甚至造成环境污染。经文献报道及前期研究工作发现，飞粉中含有丰富的魔芋蛋白和葡甘聚糖，是制备魔芋甘露聚糖肽的良好资源。
　　本研究以魔芋飞粉为原料，采用碱溶酸沉法提取魔芋蛋白，再通过酶解法制备魔芋多肽。之后采用硫酸铵沉淀法提取酶解液中的魔芋糖肽，再经过DEAE-52纤维素柱层析、Sephadex G-75柱层析和ConA-Sepharose4B柱层析的分离、纯化得到魔芋甘露聚糖肽，并对其进行了分析及抗肿瘤活性检测。具体研究结果如下:
　　1.以魔芋飞粉为原料，采用碱溶酸沉法提取魔芋蛋白，再利用碱性蛋白酶水解魔芋蛋白制备魔芋多肽，测得多肽得率为13.68％，水解度为10.32％。在此基础上研究了魔芋糖肽提取工艺，采用硫酸铵沉淀法提取酶解液中的魔芋糖肽，以糖肽提取率为指标，通过单因素实验和正交实验优化魔芋糖肽提取工艺。结果表明:在实验条件设定范围内，硫酸铵加入量对糖肽提取率影响显著，pH和沉淀时间对糖肽提取率影响不显著;硫酸铵沉淀法提取魔芋糖肽的最佳工艺条件为:硫酸铵加入量为70％饱和度、pH4.5、沉淀时间10h，此工艺下的糖肽提取率为17.21％。
　　2.研究了魔芋甘露聚糖肽的分离纯化方法。采用DEAE-52纤维素柱层析对魔芋甘露聚糖肽进行初步分离，得到1个糖、肽吸收共有峰，并通过对洗脱条件的优化，确定DEAE-52纤维素柱层析的最佳分离条件为:洗脱剂为蒸馏水和0.05、0.1、0.2 mol/L的NaCl溶液，上样量2mL，洗脱流速0.8 mL/min;再采用Sephadex G-75柱层析对魔芋甘露聚糖肽进行分离，得到1个糖、肽吸收共有峰，并优化出Sephadex G-75柱层析的最适洗脱流速为1.0 mL/min;进一步采用ConA-Sepharose4B柱层析纯化魔芋甘露聚糖肽，以吸附率为指标，探讨不同离子强度和pH对魔芋甘露聚糖肽在ConA-Sepharose4B填料上吸附率的影响，确定最佳吸附条件为:NaCl浓度0.15 mol/L、pH7.5。以脱附率为指标，考察不同α-甲基-D-甘露糖苷浓度对魔芋甘露聚糖肽在ConA-Sepharose4B填料上脱附率的影响，优选出最适α-甲基-D-甘露糖苷浓度为0.2 mol/L。
　　3.采用高效液相色谱法，对魔芋甘露聚糖肽进行分析检测，结果表明，魔芋甘露聚糖肽含有与甘露聚糖肽对照品相似的氨基酸组成;魔芋甘露聚糖肽中的单糖主要为甘露糖和葡萄糖。运用SDS-PAGE电泳测定魔芋甘露聚糖肽分子量范围为20.1～42.7ku。利用紫外-可见分光光度法，通过绘制的甘露糖标准曲线计算纯化后样品中魔芋甘露聚糖肽含量为79.51％。
　　4.采用MTT法对魔芋甘露聚糖肽进行抗肿瘤活性检测，结果表明，魔芋甘露聚糖肽对结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞HepG2的增殖均具有一定抑制作用，且在1～100μmol/L浓度范围内呈现较好的剂量依赖性，其中魔芋甘露聚糖肽对肝癌细胞HepG2的选择性优于结肠癌细胞HCT-116，对其增殖的抑制作用更为显著。利用SPSS22.0软件进行数据分析，计算魔芋甘露聚糖肽对结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞HepG2处理48 h后的IC50值分别为140.86μmol/L和57.63μmol/L。

目录

摘要

1 绪论

1．1 魔芋飞粉概述

1．1．1 魔芋简介

1．1．2 魔芋飞粉简介

1．1．3 魔芋飞粉的主要成分

1．1．4 魔芋飞粉的研究现状

1．1．5 魔芋飞粉的研究开发前景

1．2 糖肽概述

1．2．1 糖肽简介

1．2．2 糖肽的制备

1．2．3 糖肽的生物活性

1．3 甘露聚糖肽概述

1．3．1 甘露聚糖肽简介

1．3．2 甘露聚糖肽的制备

1．3．3 甘露聚糖肽的生物活性及临床应用

1．3．4 甘露聚糖肽的研究开发前景

1．4 立题背景和意义

1．4．1 立题背景

1．4．2 立题意义

1．5 研究内容

2 魔芋糖肽的提取

2．1 材料与仪器

2．1．1 材料与试剂

2．1．2 仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 双缩脲法测定多肽得率

2．2．2 甲醛滴定法测定水解度

2．2．3 魔芋糖肽提取率的测定

2．2．4 魔芋多肽制备方法

2．2．5 魔芋糖肽提取方法

2．2．6 魔芋糖肽提取中影响因素的考察

2．2．7 魔芋糖肽提取条件的优化

2．2．8 数据分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 双缩脲法测定魔芋多肽得率的结果

2．3．2 甲醛滴定法测定水解度的结果

2．3．3 单因素实验结果

2．3．4 工艺优化结果

2．4 本章小结

3 魔芋甘露聚糖肽的分离纯化

3．1 材料与仪器

3．1．1 材料与试剂

3．1．2 仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 多糖含量的测定

3．2．2 魔芋甘露聚糖肽DEAE-52纤维素柱层析分离

3．2．3 魔芋甘露聚糖肽Sephadex G-75柱层析分离

3．2．4 魔芋甘露聚糖肽ConA-Sepharose 4B柱层析纯化

3．2．5 数据分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 多糖含量测定结果

3．3．2 DEAE-52纤维素柱层析分离结果

3．3．3 Sephadex G-75柱层析分离结果

3．3．4 ConA-Sepharose 4B柱层析纯化结果

3．4 本章小结

4 魔芋甘露聚糖肽的分析与抗肿瘤活性检测

4．1 材料与仪器

4．1．1 材料与试剂

4．1．2 实验用细胞

4．1．3 仪器与设备

4．2 实验方法

4．2．1 魔芋甘露聚糖肽中氨基酸测定

4．2．2 魔芋甘露聚糖肽中单糖测定

4．2．3 魔芋甘露聚糖肽分子量测定

4．2．4 魔芋甘露聚糖肽含量测定

4．2．5 MTT法检测魔芋甘露聚糖肽的抗肿瘤活性

4．2．6 数据分析

4．3 结果与讨论

4．3．1 魔芋甘露聚糖肽中氨基酸测定结果

4．3．2 魔芋甘露聚糖肽中单糖测定结果

4．3．3 魔芋甘露聚糖肽分子量测定结果

4．3．4 魔芋甘露聚糖肽含量测定结果

4．3．5 MTT法抗肿瘤活性检测结果

4．4 本章小结

5 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

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