d-阿拉伯糖醇高产多形汉逊酵母重组菌株选育及其发酵工艺研究

摘要

D-阿拉伯糖醇，已在食品、化工、医药等领域有着广泛的应用。然而，传统的直接提取法和化学合成法的生产工艺存在产率低，底物昂贵等弊端，限制了D-阿拉伯糖醇的规模化生产。生物发酵法生产D-阿拉伯糖醇被公认为绿色生产方法，也是最有前景的生产方法之一。但是目前用于发酵生产D-阿拉伯糖醇的菌株普遍存在产率低，副产物多等问题。因此，选育出一株遗传性能良好的高产菌株尤为重要。
　　本研究首先对低能N+注入多形汉逊酵母DL-1（Hansenula polymorphaDL-1，H.polymorpha DL-1）的注入参数进行考察，确定了最佳的低能离子注入参数。进而根据D-阿拉伯糖醇高产菌株有耐高渗的特性，建立了高糖培养基初筛，纸色谱法和高效液相色谱法联合使用进行复筛的高通量筛选方法。再利用离子束转基因技术介导多形汉逊酵母基因组DNA随机转化多形汉逊酵母，结合高通量筛选方法，创建D-阿拉伯糖醇高产重组菌株。随后对高产重组菌株发酵生产D-阿拉伯糖醇的发酵工艺进行考察，确定了高产重组菌株发酵生产D-阿拉伯糖醇的最佳发酵工艺。研究结果如下:
　　(1)对多形汉逊酵母低能离子注入剂量和能量进行优化，依据多次重复试验计算出注入菌株的存活率，获得“马鞍形”曲线，确定出低能N+注入多形汉逊酵母的最佳条件:注入剂量:2.5×1016 ion/cm2;注入能量:25keV，真空条件下，脉冲注入10s，间隔10s。
　　(2)建立了高通量筛选方法，即高糖培养基初筛，纸色谱法和高效液相色谱法复筛的组合利用的高通量、快速筛选方法。
　　(3)运用低能离子束技术构建高产重组菌株，结合高通量筛选方法筛选出了一株产量为113.76g/L的高产工程菌株，被命名为H.polymorphaDLg4-14。
　　(4)以H.polymorpha DLg4-14为研究对象，运用正交试验确定了其最佳发酵条件，分别为接种时间21h，接种量5％，葡萄糖添加量为250g/L，酵母膏:硫酸铵(mol/mol)=10∶1。其中，葡萄糖的添加量对D-阿拉伯糖醇的产量有着显著的影响。在此条件下，D-阿拉伯糖醇产量为119.03g/L，转化率提高了4.63％。
　　(5)以H.polymorpha DLg4-14为研究对象，确定了最佳变温方案，即将高产重组菌株先在最适生长温度37℃恒温培养24h后，再升温至极限温度48℃恒温培养24h，最后降温至最适发酵温度34℃继续恒温培养80h;在此条件下，D-阿拉伯糖醇产量为123.92g/L，相比于恒温发酵最高产量（119.46g/L）提高了3.73％。

目录

摘要

1 绪论

1．1 D-阿拉伯糖醇简介

1．1．1 D-阿拉伯糖醇的理化性质

1．1．2 D-阿拉伯糖醇的用途

1．1．3 D-阿拉伯糖醇的生产现状

1．1．4 生物发酵法生产D-阿拉伯糖醇的国内外研究动态

1．1．5 D-阿拉伯糖醇检测方法的研究

1．1．6 发酵生产D-阿拉伯糖醇的影响因素

1．2 多形汉逊酵母的研究

1．2．1 多形汉逊酵母的生物学特性

1．2．2 多形汉逊酵母的应用

1．3 离子束生物工程的研究进展

1．3．1 离子束生物工程技术原理

1．3．2 离子束生物工程技术的特点

1．3．3 离子束生物工程技术的应用

1．4 立题意义

1．5 研究内容与技术路线

1．5．1 基本原理

1．5．2 研究内容

1．5．3 技术路线

2 低能N+注入多形汉逊酵母条件的考察

2．1 试验材料与仪器设备

2．1．1 试验材料

2．1．2 培养基

2．1．3 试剂配制

2．1．4 主要试剂与仪器设备

2．2 研究内容与方法

2．2．1 低能N+注入最佳参数考察

2．2．2 多形汉逊酵母的N+注入方法

2．2．3 测定存活率

2．3 结果与分析

2．3．1 不同注入参数注入后菌株的生长情况

2．3．2 酵母菌转化

2．3．3 测定存活率

2．4 小结

3 D-阿拉伯糖醇高产诱变酵母菌株快速筛选方法的建立

3．1 试验材料与仪器设备

3．1．1 试验材料

3．1．2 主要试剂与设备

3．1．3 试剂的配制

3．2 培养与检测方法

3．2．1 培养方法

3．2．2 分析测定方法

3．3 研究内容

3．3．1 原始出发菌株驯化培养

3．3．2 低能N+注入多形汉逊酵母

3．3．3 筛选培养基葡萄糖浓度的确定

3．3．4 纸色谱法展开体系的优化

3．3．5 建立高通量筛选方法

3．4 结果分析

3．4．1 高糖筛选培养基葡萄糖浓度的测定

3．4．2 纸色谱法展开体系优化结果

3．4．3 高效液相色谱法定量检测结果

3．4．4 高产诱变菌株的选育

3．5 小结

4 高产D-阿拉伯糖醇重组酵母菌株的构建

4．1 试验材料与仪器设备

4．1．1 试验材料

4．1．2 主要试剂与仪器设备

4．1．3 主要试剂的配制

4．2 试验方法与研究内容

4．2．1 酵母基因组DNA的提取与检测

4．2．2 酵母菌的注入

4．2．3 高产D-阿拉伯糖醇重组菌株的筛选

4．3 结果与分析

4．3．1 提取与检测酵母基因组DNA

4．3．2 高产D-阿拉伯糖醇重组菌株的筛选

4．3．3 重组菌株稳定性试验

4．4 小结

5 高产重组菌株的发酵工艺研究

5．1 试验材料

5．1．1 菌种

5．1．2 主要试剂与设备

5．1．3 培养基

5．2 试验方法

5．2．1 培养方法

5．2．2 分析测定方法

5．2．3 发酵工艺研究

5．3 结果与分析

5．3．1 绘制菌株H．polymorphaDLg4-14的生长曲线

5．3．2 最佳接种时间和接种量的确定

5．3．3 最适碳源的确定

5．3．4 氮源对D-阿拉伯糖醇产量的影响

5．3．5 氯化钠对D-阿拉伯糖醇产量的影响

5．3．6 运用正交试验确定最优发酵条件

5．3．7 培养温度对D-阿拉伯糖醇产量的影响

5．4 小结

6 结论与展望

6．1 结论

6．2 创新点

6．3 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文目录

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