猪皮胶原多肽增加骨密度作用机制及其对骨生物力学性质影响

摘要

钙元素的缺乏容易引起多种疾病，儿童钙缺乏会引起生长发育缓慢等疾病，成人钙缺乏会导致骨质疏松和骨折等。促使机体钙质缺乏的主要因素有两个，一是机体内钙质的量不足；另一个是人体内骨胶原含量不足，使摄入到体内的钙无法被固定。因此，补充矿物元素钙和补充骨胶原同等重要。目前，国内市场补钙制剂从钙源组成进行分类包括：无机钙和有机酸钙，它们是通过人体内维生素 D的诱导和胃部的酸化从而被机体吸收。两类钙制剂都存在生物利用度低、有副作用、与体内元素之间容易出现拮抗作用等缺陷。因此，开发一种新型补钙制剂非常必要。胶原多肽生物钙制剂可以为人体提供钙源，且钙吸收和利用过程不依赖维生素 D的诱导，富含的多肽能够促进人体内的骨胶原的形成。本论文以猪皮明胶为原料制备胶原多肽，对猪皮胶原多肽增加骨密度作用机制及其对骨生物力学性质影响进行了研究。 1.采用凯氏定氮法测定食品级猪皮明胶中蛋白质含量，发现所选用的猪皮明胶蛋白质含量较高，粗蛋白含量占 90.75%。使用全自动氨基酸分析仪对猪皮明胶的氨基酸成分进行了分析，结果显示猪皮明胶中含有 16种氨基酸。 2.本论文选取碱性蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶等三种酶优化单酶酶解猪皮明胶工艺，并选取胃蛋白酶和酸性蛋白酶优化双酶体系的猪皮明胶酶解工艺，优化后猪皮明胶最佳酶解条件为 A2B3C1D2，即酸性蛋白酶酶解温度 50℃，酶解溶液 pH6.0，胃蛋白酶酶解温度45℃，酶解溶液 pH3.0，在此条件下猪皮明胶水解度为 17.56%。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试验表明，双酶体系酶解猪皮明胶产物中分子量小于 5KDa 组分含量的相对比率高于碱性蛋白酶酶解产物、胃蛋白酶酶解产物和酸性蛋白酶酶解产物。 3.以胶原多肽和葡萄糖酸钙为原料，以多肽螯合钙（CP-Ca）螯合率为指标，对 CP-Ca螯合工艺条件进行优化。在最优螯合反应条件下，CP-Ca的螯合率为 78.3%。采用紫外光谱、红外光谱、X衍射、扫描电镜等手段，对制备的CP-Ca的结构进行了分析和表征，结果表明多肽与钙形成了螯合物，且多肽的羧基和氨基都和 Ca2+发生了螯合反应。 4.以 L-羟脯氨酸(L-Hyp)和葡萄糖酸钙为原料螯合制备羟脯氨酸螯合钙(L-Hyp-Ca)，经条件优化后 L-Hyp-Ca 螯合率为 79.5%。采用紫外光谱、红外光谱、X衍射、扫描电镜、重量分析、元素分析等分析方法对 L-Hyp-Ca螯合物的结构和组成进行分析和表征。通过表征分析发现，Ca与 L-Hyp中的羧基和亚氨基发生配位，经反应得到的L-Hyp-Ca配位比为 1:2，推断其分子式为 Ca(C5H8NO3)2。 5.考察了 CP-Ca 和 L-Hyp-Ca的生物活性，CP-Ca 和 L-Hyp-Ca对 DPPH·、·OH 和 O2-·均有一定的清除作用，说明这两种螯合钙具有一定的抗氧化性。促钙吸收转运试验表明：CP-Ca与 L-Hyp-Ca均能够有效提高 Caco-2细胞对钙的转运率。体外模拟消化试验研究发现，模拟胃消化环境中，CP-Ca与 L-Hyp-Ca被水解释放出部分钙离子，钙以游离态的形式存在；在模拟肠消化环境中，pH 值升高，部分钙离子与多肽和氨基酸再次螯合，CP-Ca、L-Hyp-Ca 和钙离子之间为动态平衡过程，一部分钙以离子状态直接被肠道吸收，另一部分钙则以 CP-Ca和 L-Hyp-Ca分子形式被肠道吸收。细胞存活率试验表明：CP-Ca与 L-Hyp-Ca对细胞无毒副作用，具有较好的安全性。 6.以猪皮明胶(PG)、猪皮明胶水解物(PGH)、胶原多肽(CP)为原料，以断乳雌性 SD大鼠为模型，评价了各组分增加大鼠骨密度的作用。试验过程中，每周测定大鼠的体重和身长，灌胃第 4周做 3d钙代谢试验。测定大鼠血钙(S-Ca)、血磷(S-P)含量、碱性磷酸酶(ALP)活性、大鼠骨密度(BMD)和骨钙含量，并对大鼠股骨进行扫描电镜(SEM)分析。结果显示，PG、PGH、CP-1(M＞5KDa)和 CP-2(M＜5KDa)可以促使大鼠体重增加，促使大鼠骨质增长，降低大鼠 ALP活性，能够增加大鼠的钙表观吸收率，具有增加动物体内钙吸收的作用。CP-2+CaCO3组降低大鼠 ALP活性效果较为明显，与对照组比较使其降低了 40.37%。CP-2具备促进大鼠骨生长和发育的作用，且其作用较其它组分明显。 7.以断乳雌性 SD大鼠为模型，评价了 CP-Ca增加大鼠骨密度作用。试验过程中，每周测定大鼠的体重和身长，灌胃第 4周做 3d钙代谢试验。测定大鼠血钙(S-Ca)、血磷(S-P)含量、碱性磷酸酶(ALP)活性、大鼠骨密度(BMD)和骨钙含量，并对大鼠股骨进行扫描电镜(SEM)分析。结果显示，中剂量组 CP-Ca、高剂量组 CP-Ca和高剂量组CP+CaCO3可以显著促进大鼠增重发育(p＜0.05)，降低ALP活性(p＜0.05)，增加骨密度(BMD)(p＜0.05)。各剂量组 CP-Ca和 CP+CaCO3钙表观吸收率分别高于对应 CaCO3组。高剂量组 CP-Ca与对照组比较，高剂量组 CP-Ca 使大鼠体重增加 99.92%，大鼠 ALP 活性降低48.66%，大鼠 BMD增高 15.06%，大鼠骨钙含量增高 18.47%，CP-Ca具有良好的促进大鼠生长发育、骨生长、骨钙沉积的作用。CP-Ca和 CP+CaCO3能够预防和改善大鼠因长期钙摄入不足引起的骨质疏松症。高剂量组 CP-Ca使大鼠股骨硬度、最大载荷、吸收能量、最大应力和弹性模量等骨结构力学特性指标分别提高 14.27%、8.17%、17.91%、14.43%、12.10%，CP和 Ca2+在大鼠饲养过程中同时添加具备增加大鼠骨生物力学强度的作用。 8.大鼠摄入钙元素后，主要通过肠道进行吸收，少量钙通过胃吸收，还有一部分(35%)未吸收的钙直接以粪便的形式排出体外。吸收后的钙通过主动运输和被动扩散途径进入大鼠血液和细胞间液，然后一部分被输送到全身各软组织和细胞中，一部分运输到骨组织中并在骨组织中沉积，一部分(25%)通过肾脏代谢和肾小球过滤而排出体外。通过大鼠体内钙运输路径分析发现，大鼠钙吸收的作用靶点为大鼠肠组织，大鼠体内钙运输介质靶点主要为大鼠血液，大鼠钙沉积靶点主要为大鼠骨组织，大鼠心脏、肝脏、脾脏、大脑等组织也有少量的钙沉积。

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摘 要

1 绪论

1.1 明胶概述

1.1.1 明胶的性质与结构

1.1.2 明胶的应用及功能研究现状

1.2 胶原多肽

1.2.1 胶原多肽的功能

1.2.2 胶原多肽的制备方法

1.3 补钙及补钙制剂的研究进展

1.3.1 钙的生理功能

1.3.2 我国居民钙摄入情况

1.3.3 钙缺乏对人体的影响

1.3.4 钙与骨质疏松的关系

1.3.5 市场主流补钙制剂状况

1.4 研究的背景、目的与意义

1.5 本课题研究的主要内容

2猪皮明胶成分分析及酶解条件优化

2.1 引言

2.2 试验材料

2.2.1 试验原料

2.2.2 试验仪器与设备

2.2.3 试验试剂

2.3 试验方法

2.3.2 明胶的氨基酸组成分析

2.3.3 明胶的pH值测定

2.3.4 猪皮明胶酶解过程

2.3.5 水解度的测定方法

2.3.6 羟脯氨酸含量的测定方法

2.3.7 蛋白回收率的测定

2.3.8 蛋白酶的筛选

2.3.9 单酶体系最佳酶解工艺优化

2.3.10 双酶体系酶解工艺优化

2.3.11 猪皮明胶酶解物聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析

2.4 结果与分析

2.4.2 明胶的氨基酸组成分析

2.4.3 明胶的pH值

2.4.4 羟脯氨酸标准曲线的绘制

2.4.5 蛋白酶的筛选

2.4.6 单酶体系最佳酶解工艺优化

2.4.7 猪皮明胶单酶酶解物SDS-PAGE分析

2.4.8 双酶体系酶解工艺优化

2.4.9 猪皮明胶双酶体系酶解物SDS-PAGE分析

2.5 讨论

2.6 小结

3 猪皮胶原多肽螯合钙的制备工艺

3.1引言

3.2 材料与方法

3.2.1 试验原料

3.2.2 试验仪器与设备

3.2.3 试验试剂

3.2.4 试验方法

3.3 结果与分析

3.3.1 Plackett-Burman(PB)试验设计结果与分析

3.3.2 CCD优化设计结果与响应面分析

3.3.3 验证试验

3.3.4 紫外光谱(UV)分析

3.3.5 红外光谱(IR)分析

3.3.6 扫描电镜(SEM)分析

3.3.7 X衍射分析

3.4 讨论

+Ca2+

3.5 小结

4 L-羟脯氨酸-Ca的制备及配合机制

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 试验原料

4.2.2 试验仪器与设备

4.2.3 试验试剂

4.2.4 试验方法

4.3 结果与分析

4.3.1 单因素试验结果

4.3.2 正交试验结果

4.3.3 紫外光谱(UV)分析

4.3.4 红外光谱(IR)分析

4.3.5 X衍射分析

4.3.6 扫描电镜(SEM)分析

4.3.7 元素分析

4.3.8 重量分析

4.4 讨论

4.5 小结

5 CP-Ca与L-Hyp-Ca螯合活性分析

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 试验原料及试验动物

5.2.2 试验仪器与设备

5.2.3 试验试剂

5.2.4 试验方法

5.3 结果与分析

CP-Ca和L-Hyp-Ca样品，浓度分别配制为0.30mg/mL、0.60mg/mL、0.90mg

5.3.2 不同样品对1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH·)清除能力的测定

5.3.3 不同样品对羟基自由基(·OH)清除能力的测定

5.3.4 不同样品对超氧阴离子(O2-·)抑制能力的测定

5.3.5 CP-Ca与L-Hyp-Ca对细胞存活率的测定

5.4 讨论

5.5 小结

6 猪皮明胶、明胶水解物及多肽螯合钙增加大鼠骨密度和对大鼠骨组织生理学性能影响

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 试验原料及试验动物

6.2.2 试验仪器与设备

6.2.3 试验试剂

6.2.4 试验方法

6.3 结果与分析

6.3.1 猪皮明胶和明胶水解物对大鼠体重和身长的影响

6.3.2 多肽螯合钙对大鼠体重和身长的影响

6.3.3 猪皮明胶和明胶水解物对大鼠血钙(S-Ca)、血磷(S-P)含量和碱性磷酸酶(ALP)活性

6.3.4 多肽螯合钙对大鼠血钙(S-Ca)、血磷(S-P)含量和碱性磷酸酶(ALP)活性影响

6.3.5 猪皮明胶和明胶水解物对大鼠骨密度(BMD)、骨钙含量和钙表观吸收率影响

6.3.6 多肽螯合钙对大鼠骨密度(BMD)、骨钙含量和钙表观吸收率影响

6.3.7 猪皮明胶和明胶水解物试验组大鼠股骨扫描电镜(SEM)分析

6.3.8 多肽螯合钙试验组大鼠股骨扫描电镜(SEM)分析

6.3.9 多肽螯合钙试验组大鼠股骨生物力学分析

6.4 讨论

6.5 小结

7 45Ca标记胶原多肽螯合钙示踪体内运输路径及作用靶点

7.1 引言

7.2 材料与方法

7.2.1 试验原料及试验动物

7.2.2 试验仪器与设备

7.2.3 试验试剂

7.2.4 试验方法

7.3 结果与分析

7.3.1 大鼠不同组织钙离子沉积和钙离子含量测定

7.3.2 胶原多肽螯合钙在大鼠体内代谢试验

7.4 讨论

7.5 小结

8 结论

8.1结论

1.猪皮明胶原料成分分析

2.猪皮明胶水解工艺条件优化

3.胶原多肽螯合钙的制备及螯合机理研究

5.猪皮明胶、猪皮明胶水解物、胶原多肽和胶原多肽螯合钙对大鼠骨密度和大鼠骨生物学性质影响

6.胶原多肽螯合钙在大鼠体内运输路径及作用靶点

8.2创新点

8.3进一步工作

致 谢

时光荏苒，六年的时间转瞬即逝，六年的求学经历也为我今后的人生旅途和科研道路打下了坚实的基础。

首先，非常感谢我的导师董文宾教授，从论文的选题指导，到论文的最终定稿，董老师都提出了很多宝贵的意见和

参考文献

攻读学位期间发表的论文目录

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