4株乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定

摘要

乳酸杆菌的蛋白水解系统包括细胞胞壁蛋白酶（cell-envelope proteinase,CEP），寡肽转运系统和内肽酶。其中，CEP作为该系统的关键酶发挥着重要作用，不仅参与酪蛋白降解，助发酵产品风味和质地的形成，还可酶解食物蛋白释放出生物活性肽，有益于消费者健康。目前关于乳杆菌CEP分离纯化的报道不多，对其结构鉴定更是鲜有报道，本课题采用不同提取方法研究4种乳杆菌CEP的提取效果；探讨双水相系统对CEP分离的影响，单因素及响应面法优化确定双水相分离CEP最佳条件；采用超滤、葡聚糖凝胶色谱对其分离纯化；电泳测酶分子量，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF-MS）鉴定CEP，比较不同乳杆菌的产酶差异。研究结论如下： 1.选取的10种方法提取4株乳杆菌CEP存在显著差异。Ca2+-free法为植物乳杆菌LP69和鼠李糖乳杆菌LR22CEPs的最适提取方法；保加利亚乳杆菌LB6和干酪乳杆菌L61CEPs的最适提取剂分别是盐酸胍和十二烷基硫酸钠（SDS）。综合考虑提取方法对四株菌的通用性及效果，选用Ca2+-free法处理4种乳杆菌细胞，其粗酶液酶活分别为6.28U/mL、8.98U/mL、6.08U/mL、47.59U/mL，其比活力分别为70U/mg、90U/mL、200U/mL、210U/mL。 2.单因素及响应面法优化确定了4株乳杆菌CEP的双水相萃取条件。植物乳杆菌LP69CEP的最佳萃取条件为：30%(w/v)(NH4)2SO4，30%(w/v)PEG-1000，pH7.0，在此条件下，CEP回收率和纯化倍数分别为90.83%和2.57；鼠李糖乳杆菌LR22CEP的最适萃取条件为：30%(w/v)(NH4)2SO4，25%(w/v)PEG-1000，pH6.7，CEP回收率和纯化倍数各为91.05%和1.11；保加利亚乳杆菌LB6CEP的最佳萃取条件为30%(w/v)(NH4)2SO4，30%(w/v)PEG-4000，pH7.0，CEP回收率和纯化倍数各为86.67%和1.25；干酪乳杆菌L61CEP的最佳萃取条件为40%(w/v)NaH2PO4，15%(w/v)PEG-1000，pH6.8，CEP回收率和纯化倍数各为92.94%和1.95，表明双水相萃取法提取乳杆菌粗酶液CEP是可行的。 3.超滤、Sephadex G-100凝胶层析进一步纯化了4株菌的CEP，电泳测定了纯度和分子量；三种截断分子量（100K Da、50K Da、10K Da）超滤膜分离双水相萃取的4株乳杆菌CEP，发现LB6酶活最高的组分的分子量在50K Da~100K Da超滤液中，其它三株菌CEP酶活最高的组分的分子量在10K Da~50K Da超滤液中。凝胶色谱纯化后LP69CEP的比活力、CEP回收率和纯化倍数分别为976U/mg、45.32%和13.94；LR22CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为410U/mg、23.43%和4.56；；LB6CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为1180U/mg、33.58%和5.90；L61CEP的比活力、回收率和纯化倍数分别为5310U/mg、21.12%和25.29。4株菌CEP的电泳结果均为单一条带，分子量分别约为45K Da、80K Da、30K Da和38K Da。采用LC-MS/MS对4株乳杆菌CEP进行分析，得到多肽的分子量在600-1800Da范围内。4株乳杆菌CEP均存在6种相同肽段SIEDTK、RMISVAR、TIDDLK、QSELKAATK、YISTK、FLEQQNK。 本课题研究乳杆菌CEP最适提取方法及双水相体系萃取CEP，为后续开发具有生物活性的功能性产品提供技术依据；研究获得了不同乳杆菌CEP的氨基酸组成，这可为后续基因工程表达制备CEP提供参考。

目录

1 前言

1.1 乳酸菌

1.2 胞壁蛋白酶

1.3 胞壁蛋白酶提取研究进展

1.4 双水相萃取胞壁蛋白酶

1.5 胞壁蛋白酶的分离纯化

1.6 胞壁蛋白酶结构鉴定

1.7 目的意义及研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 技术路线及实验方法

3 结果与讨论

3.1 酪蛋白及蛋白质标准曲线的建立

3.2 探究提取方法对乳杆菌胞壁蛋白酶的影响

3.3 双水相法优化乳杆菌胞壁蛋白酶萃取条件

3.4 乳杆菌胞壁蛋白酶的分离纯化及鉴定

4 结论、创新点和展望

4.1 结论

4.2 创新点

4.3 展望

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的成果目录

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