灰树花发酵液多糖提取及其活性测定

摘要

1、利用平板培养和液体培养比较了8个灰树花菌株。发现固体平板培养中，菌株的平均日生长速度为5.0～6.5mm/d，菌丝体均为白色，216菌株、270菌株和275菌株的菌丝生长量较慢，但是菌丝绒毡状，生长均匀，边缘整齐，菌丝致密。摇瓶培养表明，菌株间的菌体干重差别不大，粗多糖含量以270菌株和275菌株最高，分别为7.7mg/mL和7.8mg/mL。发酵罐测试表明:随着培养时间的延长，pH逐渐降低，最后维持在pH3～4，菌丝体生长量为20～22mg/ml，总糖测试表明270菌株和275菌株可以达到30mg/mL，其它几个菌株略低。
　　 2、采用响应面分析中的Box-Behnken试验优化了灰树花胞内多糖提取条件，结果表明，实验范围内多糖最佳提取条件为提取温度92.53℃，浸提时间2.24h，水料比35.76∶1，在此条件下多糖的理论提取率为7.28％，验证值为7.15％。表明响应面法能够较好的分析提取温度、提取时间及料水比等多个因素对灰树花胞内多糖提取的影响作用，并且回归方程的预测值与试验值符合度较高。
　　 3、研究了灰树花多糖的提取纯化方法。分别对胞内多糖提取液和胞外多糖提取液进行浓缩、除色素、脱蛋白处理，并利用乙醇进行分步醇析。实验表明，胞内多糖总产率为2.19g/L，胞外多糖总产率为1.68g/L，胞外多糖产率略低。通过对多糖组分进行SephadexG-100分子筛柱层析，分离到胞内多糖组分IP30-Ⅰ、IP60-Ⅰ、IP60-Ⅱ和IP83-Ⅱ，得到胞外多糖组分EP60-Ⅰ、EP60-Ⅱ和EP83-Ⅰ。
　　 4、测试了灰树花胞内多糖对S180荷瘤昆明小鼠的抑瘤作用。荷瘤小鼠随机分为四组:低剂量多糖组(200mg/kg.d)、高剂量多糖组(500mg/kg.d)、环磷酰胺阳性对照组(20mg/kg.d)和生理盐水阴性对照组。给药10d后计算肿瘤抑制率。结果表明:与阴性对照组相比，低剂量多糖组和高剂量多糖组抑瘤率分别达到61.51％(P＜0.01)和44.42％(P＜0.01)，环磷酰胺组抑瘤率为73.75％(P＜0.01)。测试了灰树花多糖不同组分对肝癌Hep细胞的体外抑制试验，以蒸馏水为阴性对照组、以氟尿嘧啶为阳性对照组。结果表明:胞内多糖的抑制效果好于胞外多糖，其中最高可以达到抑制率66％。
　　 5、测定了灰树花发酵液胞内多糖的单糖组份及其摩尔比。将胞内多糖IP30、IP30-Ⅰ、IP60、IP60-Ⅰ、IP60-Ⅱ分别水解为单糖，采用HPLC法测定其组成及摩尔比。结果表明:IP30含8种单糖，IP30-Ⅰ则由7种单糖组成;IP60含7种单糖，IP60-Ⅰ由6种单糖组成，IP60-Ⅱ则含4种单糖。5个多糖组份中，都含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，而且都以葡萄糖含量最多;除IP60-Ⅱ外其余4个组份中都含有1种10种标准单糖之外的未知糖，而且IP60和IP60-Ⅰ中含量多，仅次于葡萄糖。

目录

摘要

1 前言

1．1 灰树花研究概况

1．1．1 灰树花生物学特性

1．1．2 灰树花营养价值

1．1．3 灰树花保健功能

1．1．4 灰树花人工栽培

1．1．5 灰树花深层液体发酵

1．1．6 灰树花多糖的提取、分离与纯化方法

1．1．7 灰树花多糖的结构分析

1．1．8 灰树花多糖的生物活性

1．1．9 灰树花中海藻糖的研究

1．1．10 灰树花分子生物学研究

1．2 本项目研究意义

1．3 本项研究主要内容

2 灰树花菌株筛选试验

2．1 材料和方法

2．1．1 材料

2．1．2 方法

2．2 结果

2．2．1 固体平板培养

2．2．2 摇瓶液体发酵

2．2．3 发酵罐培养

2．3 小结

3 灰树花胞内多糖提取条件优化

3．1 材料和方法

3．1．1 材料

3．1．2 方法

3．2 结果

3．2．1 单因素影响试验

3．2．2 响应曲面法分析胞内多糖提取条件

3．3 讨论

4 灰树花发酵液多糖的分离纯化

4．1 材料与方法

4．1．1 材料

4．1．2 方法

4．2 结果

4．2．1 灰树花多糖的提取

4．2．2 灰树花多糖分子筛柱层析

4．3 小结

5 灰树花多糖的抗肿瘤作用

5．1 材料与方法

5．1．1 材料

5．1．2 灰树花多糖获取方法

5．1．3 动物体内试验

5．1．4 体外细胞试验

5．2 结果

5．2．1 灰树花胞内多糖体内抑瘤作用

5．2．2 灰树花多糖体外抑制肿瘤细胞作用

5．3 讨论

6 灰树花胞内多糖的单糖组份测定

6．1 材料与方法

6．1．1 材料

6．1．2 方法

6．2 结果

6．3 小结

7 结论及进一步研究的建议

7．1 结论

7．2 进一步研究的建议

参考文献

致谢

声明