RGD特异性结合多肽与新型肿瘤坏死因子融合基因的克隆表达及表达产物的抑瘤活性研究

摘要

目前涉及肿瘤坏死因子的工作主要包括以下方面:一是通过遗传操作获得突变体,降低毒副作用;二是将肿瘤坏死因子与其它蛋白共同构建双功能的融合蛋白;三是用化学物质如二乙烯醚和马来酸酐、聚乙二醇(PEG)对肿瘤坏死因子进行修饰;四是在临床应用中将肿瘤坏死因子与其它细胞因子或加热疗法联合应用.该实验中,我们应用聚合酶键式反应技术时nrhTNF氨基端的酶切位点进行改造,并人工合成了编码CRGDC的寡核苷酸片断,二者连接后,克隆入pGEM3zf质粒,序列分析表明,合成片断成功的插入nrhTNF氨基端.将融合基因克以隆入pBV-220表达载体中,在大肠杆菌中得到高效表达,表达量占菌体总蛋白的31﹪.在此基础上,又建立了利用硫波铵沉淀、常压阴,阳离子交换色谱技术从大肠杆菌中分离提取表达产物的流程,成功纯化了RGD-nrhTNF,经SDS-PAGE鉴定结果:RGD-nrhTNF触合蛋白的纯度这92﹪以上,蛋白回收率为2.57﹪.体外L929细胞杀伤实验证实比活性达到5.7×10<'8>,在昆明种小鼠体内接种腹水瘤细胞S180,建立肿瘤模型,抑瘤实验表明:当RGD-nrhTNF的剂量为12×l10<'5>IU/kg时,抑瘤率达到84.9﹪,与对照组、相同剂量的nrhTNF(肿瘤抑制率为59.O9﹪)组相比,有明显差异(P<0.01).且优于环磷酰法组(肿瘤抑制率为71.21﹪).

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