肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNF融合蛋白及制备方法

摘要

本发明公开了一种肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人nrhTNF融合蛋白及其制备方法，将人肿瘤坏死因子氨基末端的1－7位氨基酸去除，将8－10位氨基酸改变为Arg－Lys－Arg(精氨酸－赖氨酸－精氨酸)将羧基末端157位氨基酸改变成Phe(苯丙氨酸)，构建了高效低毒的新型人肿瘤坏死因子nrhTNF。在此基础上，选用从噬菌体展示文库中筛选出的能与αvβ3整合素特异性高效结合的含五个氨基酸的环肽CRGDC，利用基因工程方法将其融合在nrhTNF的氨基末端，制备的肿瘤新生血管特异性结合多肽与nrhTNF融合蛋白，能在肿瘤新生血管处富集，从而提高肿瘤坏死因子的治疗特异性，减少全身用量，降低毒副反应，提高量效比。

说明书

                        技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及基因克隆、基因突变、外源基因在原核细胞中的表达、目的蛋白质的纯化、肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白的体内外活性测定及理化性质的鉴定等技术。进一步涉及肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白及其制备方法，肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白作为抗肿瘤药物，能够特异性作用于肿瘤组织新生血管内皮细胞及肿瘤细胞。

                        背景技术

2.1肿瘤坏死因子相关研究

肿瘤坏死因子(TNF)是一种多功能的细胞因子，参与机体的免疫代谢调节，对某些癌细胞具有增殖抑制和细胞毒作用。肿瘤坏死因子还是一种感染性介导因子，在机体的炎症中起重要作用。

2.1.1肿瘤坏死因子的生物效应

抗肿瘤及抑瘤作用：肿瘤坏死因子对多种肿瘤均有杀伤或抑制作用，敏感性因肿瘤细胞类型而异。肿瘤坏死因子的抑瘤机制尚不完全清楚，可能包括①、肿瘤坏死因子为激发性细胞因子，可启动广泛的免疫炎性反应，介导自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞对癌细胞的杀伤作用；②、肿瘤坏死因子可作用于血管内皮细胞，使肿瘤的血管变形受损或形成血栓，导致肿瘤发生出血性坏死或营养缺乏而消退；③、肿瘤坏死因子可通过诱导某些肿瘤细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增生。

抗病毒作用：肿瘤坏死因子呈剂量依赖性地抑制病毒介导的细胞病变的发展，对DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用。肿瘤坏死因子可以诱导未感染细胞产生抗病毒能力，还可选择性的杀伤病毒感染的细胞。现已证实，多种病毒等也可刺激肿瘤坏死因子的产生。

免疫调节作用：肿瘤坏死因子能够增强T细胞产生以IL-2为主的淋巴因子，提高IL-2的表达水平，从而促进T细胞的增殖；还能促进B细胞的增殖、分化和产生抗体。此外，肿瘤坏死因子还能诱导单核-巨噬细胞系统的前体细胞分化，增强其吞噬能力和氧化代谢水平，提高巨噬细胞抗原提呈能力。并可促进骨髓基质细胞和巨噬细胞产生CSF，特别是GM-CSF，可促使骨髓释放中性粒细胞和巨噬细胞。

肿瘤坏死因子还可以诱发炎症反应，是一种急性期反应的强力诱导剂。

对结缔组织的作用：可诱导破骨细胞吸收骨质、促进软骨细胞进行软骨更新，抑制新骨形成。肿瘤坏死因子还可以刺激成纤维细胞和滑膜细胞的增生，引起关节组织的纤维化和增生。

2.1.2肿瘤坏死因子的应用现状

由于肿瘤坏死因子的抗肿瘤作用和多种免疫调节作用，肿瘤坏死因子疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床研究均表明：肿瘤坏死因子对某些肿瘤具有明显的抑制作用；但是由于副作用较大，限制了它的临床应用。肿瘤坏死因子的副作用包括：发热、头痛、恶心、呕吐、全身倦怠、肌肉酸痛等；高剂量时可导致休克、肾功能不全和DIC形成等。建立合理的用药方案及治疗措施，可望降低用量，减轻副作用，达到最佳治疗效果。

静脉注射rhTNF可使部分肿瘤缩小，但是副作用大，人体很难耐受。

瘤内注射可在局部出现坏死，且副作用较轻，对某些肿瘤的治疗效果优于静脉注射。已报告的有效病例包括肾癌、胃癌、肝癌等，并使转移性大肠癌腹水减少。

肿瘤坏死因子与其他药物的联合应用：单独使用TNF用量大，不容易获得好的效果，患者常因不能耐受其副作用而中止用药。将其它具有肿瘤抑制作用的细胞因子(如IL-2、IFN等)或某些抗肿瘤药物(如ADM、MMC、DDP)与TNF联合应用，既可减少各种药物的用量、降低毒副作用，又可提高疗效，不失为肿瘤治疗的一种可行方法。

加热疗法：对机体加热可明显增强TNF的抗肿瘤作用但加热在增强其抗肿瘤活性的同时，也增强了TNF对机体的毒性。因此常建议以常温下治疗量的十分之一作为热疗法中的起始剂量，故可能有助于降低TNF用量，增加疗效。

基因疗法：将TNF基因转染自体的抗癌效应细胞，如淋巴因子活化的杀伤细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞、细胞毒淋巴细胞和巨噬细胞，然后将其回输到体内使之产生TNF；或者转染自体的癌细胞并进一步制备成癌细胞疫苗，从而达到治疗目的。Rosenberg曾用TNT基因转染黑色素瘤患者的TIL，50例晚期患者接受了转染的TIL，5例可评价的病人中有1例肿瘤完全消退。研究表明TIL对肿瘤细胞有高度特异性，是理想的靶向细胞。构建放射线诱导的hTNF逆转录病毒载体并转染小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和黑色素瘤细胞(B16、F10)，从而为临床开展瘤内注射TNT基因载体并使用局部放疗奠定了基础。新近已获得了基因转染胃癌细胞MKN28、BGC823和小鼠成纤维细胞NIH3T3的阳性克隆，前者对两株胃癌细胞的生长抑制率达70％左右，后者能明显抑制肝癌细胞H22生长(P＜0.05)和提高小鼠存活率(P＜0.025)。用缺陷型逆转录病毒将TNFα基因导入肝癌细胞H22，然后用⁶⁰Co照射制备成瘤苗，据报道该瘤苗的致瘤性明显下降，对肝癌H22有很好的治疗作用。

肿瘤坏死因子的化学修饰：将TNF与二乙烯醚和马来酸酐的聚合物(DIVEMA)相连结，生成的IVEMA-TNFα的抗癌活性比天然TNF约高100倍。动物实验表明该杂交分子在体内的抗癌活性不易衰减，治疗的5只荷瘤(Meth-A)小鼠的肿瘤全部消退。Tsutsumi等对聚乙二醇(PEG)修饰TNF进行了系列研究。发现有56％赖氨酸残基连结到PEG上，杂交分子的抗瘤活性比原型TNF大100倍，且无毒性；PEG的分子量及修饰的程度决定PEG-TNFα杂交分子的大小；在体内分子量100-110kD的PEG-TNTα的抗癌活性最强；经PEG修饰的TNF的增效作用缘于它有更长的血浆半衰期和对肿瘤有更高的“亲和”作用。

肿瘤坏死因子的定位基因突变：根据对TNF结构与功能关系的研究结果，对TNF的核苷酸的置换、插入或删除来定向改变基因的序列，从而达到使TNF增效减毒的目的。用该法已获得了大量的TNF衍生物。

2.2肿瘤血管抑制剂研究现状

异常活跃的血管发育是恶性肿瘤生长的一个重要条件。肿瘤血管有3个要素使其成为开发抗癌药物的一个较好的靶标。第一、同基本处于静止状态的正常血管相比，肿瘤血管内皮细胞处于高度生长状态，因此成为突出目标。第二、肿瘤血管细胞是从正常组织进入肿瘤的正常细胞，基因组稳定，不像肿瘤细胞那样易于产生多种耐药性。第三、尽管各种肿瘤细胞差异较大，其血管细胞的差异却很小，因此同一种药物如果针对肿瘤血管则可能对多种肿瘤均有效果。

2.2.1肿瘤血管生成抑制剂的研究策略

血管生成抑制剂的研究主要有如下5种策略：1.可溶性细胞因子阻断剂；2.血管生成抑制剂；3.基质蛋白酶抑制剂；4.αvβ3整和素抑制剂；5.内皮细胞靶向抑制剂。

可溶性细胞因子阻断剂：血管内皮生长因子(VEGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)a和b被认为是肿瘤血管生成的重要启动子。干扰VEGF和bFGF的血管生成作用的方法已证明能够使小鼠肿瘤消退，这些方法包括应用单克隆抗体拮抗VEGF以及通过根除bFGF释放所必需的结合蛋白来防止细胞外层bFGF活性的释放。

血管生成抑制因子：合成的内皮细胞增殖抑制剂，如合成的烟曲霉素衍化物，或内源性血管生成抑制剂，它们的生理学功能是使血管保持静止状态或者是取消生理上的血管生成。内源性制剂是高效内皮增殖抑制剂，而且可能比合成制剂更有效，因为它们也可能抑制与肿瘤血管扩张有关的毛细血管重造。angiostatin和endostatin是当前最有效的制剂，这两种都有显著的抗肿瘤活性。

基质蛋白酶抑制剂：基质在肿瘤血管形成过程中也发挥着重要作用，肿瘤细胞、内皮细胞可分泌一些降解酶，降解基膜，以利于肿瘤和内皮细胞的迁移浸润和血管的形成，基质降解产物如层粘蛋白，也可刺激内皮细胞增殖。抗层粘蛋白抗体阻滞了瘤株血管样结构的形成和内皮细胞与层粘蛋白的粘附。BB₉₄是一种小分子物质，与MMP中Zn离子结合位点结合，抑制其活性，低浓度的BB₉₄可使MMP活性下降50％，抑制了动物模型中肿瘤的浸润和血管的形成，临床上患者腹腔注射BB₉₄，明显减少了晚期卵巢癌患者的腹水。

αvβ3整合素抑制剂：基于在动物模型中获得的临床前数据，已在患晚期癌症的患者中进行了αv整和素拮抗剂的临床I、II期实验，人源化的抗αvβ3的单克隆抗体LM609(vitaxin)已成功的完成了临床I期实验。在受试的14名患者中，8名病情稳定和/或肿瘤消退。在连续使用22个月后，无任何毒副作用。这次临床实验是首次在人体内应用导向性的抗血管生成剂。临床数据与动物模型中的数据相符。目前，为进一步评价vitaxin长期使用的有效性，正在进行II期临床实验。同时，还在患晚期癌症的患者中进行了αvβ3/αvβ5的小分子拮抗剂疗效的临床I期实验。

2.2.2存在的问题

虽然在肿瘤抗血管治疗以及肿瘤坏死因子临床应用中取得了一些成绩，但还存在着许多问题

基因工程内源性血管生成抑制剂：如应用单克隆抗体拮抗VEGF以及通过根除bFGF释放所必需的结合蛋白来防止细胞外层bFGF活性的释放，或应用基质金属蛋白酶抑制剂等，它们只抑制一种正因子。实际上存在一组血管生成因子，在肿瘤组织中表达上调。

抗肿瘤血管生成的基因治疗：目前仍在初级阶段，还需要进一步维持外源基因在体内持续高水平的表达，包括①设计的载体能够高效的进入靶细胞；②转移的基因永久的进入靶细胞基因组；③载体不引起宿主的免疫反应；④选择有效的药物抑制机体对载体的免疫反应；⑤设计在体内能够产生较长半衰期生物活性的抗血管生成蛋白的基因密码；⑥防止启动子被宿主细胞封闭。此外，还要更多的了解正常血管表型和肿瘤生成新血管的不同。一些资料显示：肿瘤形成的新血管与正常血管的结构不同，如肿瘤血管易渗漏和排列异常，成扇形或螺旋形。

应用单抗效应剂：80年代初出现并逐渐成熟的杂交瘤技术，使单抗介导的向肿瘤组织定向(靶向)运送显像或治疗药物，从而减小全身用药的毒副作用成为可能。有关单抗与核素、化疗药物、毒素、酶以及生长因子等效应剂偶联，并用于动物肿瘤模型及临床试验的报道屡见不鲜。然而，迄今为止距达到“有足够的抗体携带效应剂到达肿瘤部位并持续发挥抗瘤作用而对正常组织无毒副作用”这一目标仍有距离，主要是由于抗体本身存在的问题，如较低的靶向特异性、低穿透力、弱亲和力及抗体的免疫原性等。部分是由于肿瘤带来的障碍，如肿瘤血供的异质性及肿瘤抗原及其分布的多变性、肿瘤组织间质高灌注压、肿瘤特别是实体瘤内结合位点的空间位阻，即抗体不易与肿瘤组织内部的瘤细胞结合(抗体进入肿瘤的量与肿瘤大小成反比)。因此在实际应用中，仅有极少量抗体能到达肿瘤并与之结合，通常小于注射总量的1％。近来基因工程技术的进展使新一代基因工程抗体的特异性、亲和力均有提高，加之人们对抗体效应剂复合物的药代动力学的深入了解，以及多种效应剂的联用，高效、特异、低毒性地向肿瘤组织运送治疗或显像药物已成为可能。

2.3特异性结合多肽的研究现状

噬菌体显示技术的出现和发展为人们大规模发展和筛选新型抗肿瘤药物提供了强有力的手段。同时随着噬菌体展示多肽库技术的发展，应用小肽模拟抗原抗体反应已成为发展的趋势。这是因为：(1)含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的抗原决定簇；(2)多数情况下，几个关键残基与它的结合分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分，即蛋白质之间的相互作用是通过局部肽段间的相互作用实现的。这类导向性药物，不仅具有结合特异性和高效性，还克服了单抗效应剂分子量较大，穿透能力弱的缺点。目前，基于导向药物中导向分子小型化的发展趋势，利用噬菌体展示多肽库技术筛选出能够与目的分子结合的短肽，在体外合成编码这一短肽的核苷酸序列，与弹头分子基因融合，表达出具有导向作用的多肽-弹头分子，由短肽发挥导向作用，弹头分子可以是细菌毒素、细胞因子、化疗药物等，这一药物设计策略已显示出良好的应用前景。

1998年，Ruoslahti等利用噬菌体随机肽库筛选得到的与整合素分子αvβ3高度结合的肽，并用此肽与阿霉素交联，可将药物富集到肿瘤组织，在小鼠肿瘤模型中获得极好的治疗效果。随后，他们又把筛选到的肽与一段可诱导细胞凋亡的肽连接，在小鼠肿瘤模型中同样显示出杀瘤效应。从而提示：肽导向抗癌药物具有良好的应用前景。

Angelo Corti等利用基因工程手段，将从噬菌体展示肽库中筛选出的能特异性与氨肽酶(CD13)结合的五肽CNGRC通过一个甘氨酸连到天然人肿瘤坏死因子的氨基端，实验证明，改建后的融合蛋白在体外肿瘤细胞杀伤实验中具有与天然肿瘤坏死因子相近的活性，在体内实验中，与天然肿瘤坏死因子相比，改建后的融合蛋白具有更高的量效比，更低的毒副反应，虽然没有直接的组织学证据证明改建后的融合蛋白能在肿瘤血管部位富集，但是以下实验证明了改建后的融合蛋白活性提高与CNGRC的关系：同时注射游离的CNGRC肽能有效的抑制融合蛋白的体内抑瘤活性，使之达到与天然肿瘤坏因子相近的水平，而对天然肿瘤坏死因子的体内抑瘤活性无影响；用胰蛋白酶消化CNGRC-TNF和TNF，得到并分离消化产物TNF3-156片断，CNGRC-TNF和TNF的消化产物具有相同的体内抑瘤活性。抗CD13的单克隆抗体能显著抑制CNGRC-TNF的体内抑瘤活性，使之达到与天然肿瘤坏死因子相同水平；而对天然肿瘤坏死因子无明显抑制作用。在移植肿瘤生长12天以后，CNGRC-TNF和TNF二者的杀伤活性才出现明显差别，说明CNGRC-TNF可能通过作用于肿瘤的新生血管而具有较高的量效比。

周雪等人设计并构建了两个在水蛭素C端融合RGD序列的嵌合分子。在大肠杆菌中进行表达并纯化了表达产物，活性分析表明嵌合体蛋白在保留水蛭素抗凝血酶活性的同时，还呈现抗血小板聚集活性。从而也证实了特异性结合多肽作为导向分子的合理性和可行性。

                        发明内容

综上所述，本发明的目的在于，提供一种肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白，其特征在于，分别用定位基因突变技术使野生型hTNFαN端的7个氨基酸缺失，并将8、9、10位的脯氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸改为精氨酸、赖氨酸、精氨酸，同时将C端157位的亮氨酸置换成苯丙氨酸，获得新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNFα；应用基因克隆技术，构建肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。

制备如上所述的肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白的方法，按以下步骤制备：

1)分别用定位基因突变技术使野生型hTNFαN端的7个氨基酸缺失，并将8、9、10位的脯氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸改为精氨酸、赖氨酸、精氨酸，同时将C端157位的亮氨酸置换成苯丙氨酸，获得新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNFα；

2)RGD-nrhTNF融合蛋白基因的克隆

pGEM3zf-nrhTNF质粒由本中心保存；它的克隆位点是EcoRI和PstI，首先设计了一对引物将5’端的EcoRI突变为BamHI；

引物1：(5’端引物，41nt)：CGGAATTC ATG CGC AAA CGT AAG CCTGTA GCC  CAT GTT GTA

引物2：(3’端引物，32nt)CGC TGC AGT CAG AAG GCA ATG ATC CCAAAG TA

对pGEM3zf-nrhTNF进行PCR扩增；

PCR扩增反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板DNA及其他反应组分，94℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，30s变性反应；55℃，30s退火反应；72℃，30s扩增反应，进行30次循环，于72℃延伸10min；

PCR产物用BamHI+PstI双酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段，命名为m-nrhTNF；

按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码CRGDC导向肽的核酸片断；

片段1(28nt)：AATTC ATG TGT GAT TGT CGT GGC GAT TG

片段2(50nt)：TTT TTG TGG ATC CAC CTC TGG TTC TGG TAA ATCTTC TGA AGG TAA AGG TG

片段3(40nt)：GAT CCA CCT TTA CCT TCA GAA GAT TTA CCA GAACCA GAG G

片段4(38nt)：TGG AGC CAC AAA AAC AAT CGC CAC GAC AAT CACACA TG

将合成的四个片段于65℃变性5min，退火，再与m-nrhTNF及用EcoRI+PstI处理过的pGEM3zf(-)质粒连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的RGD-nrhTNF融合基因原核克隆载体，进行DNA序列分析。测序正确者命名为pGEM3zf-RT。其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与nrhTNF融合蛋白的基因；

3)表达载体的构建及重组蛋白的诱导表达

测序正确的pGEM3zf-RT经EcoR I和PstI消化，回收约500bp的DNA片段，与经上述相同限制性内切酶处理的pBV220质粒连接，转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR I和PstI双酶切鉴定、筛选；正确的克隆被命名为pBV-RT；正确重组的pBV-RT/DH5α菌，于LB中30℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD_650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h；3000rpm离心15min收集菌体；

4)重组蛋白的纯化

按1克菌体加5ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，用高压细胞破碎器裂解菌体，1M MgCl₂ 0.4ml，4℃搅拌均匀后，加入1mg/ml DNaseI 20μl，4℃搅拌10m，12000rpm，离心15m，收集上清，加固体硫酸铵至50％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15m，收集上清；用50倍体积的A液：20mM Tris·Cl pH8.0，1mM EDTA透析过夜，中间换液三到四次；透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.3MNaCl，20mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性，取活性峰对50倍体积的C液：20mM PB pH6.0透析过夜，中间换液三到四次；透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharoseFast Flow层析纯化，洗脱D液为20mMPB，pH6.0，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测；

5)重组蛋白的体外生物学活性检测

肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行；

6)重组蛋白的体内生物学活性检测

建立小鼠S180腹水瘤移植瘤模型，以RGD-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、环磷酰胺、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时小鼠移植瘤瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后小鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应；

肿瘤生长抑制率可按下列公式计算：

同时按以下公式计算小鼠治疗前后体重变化，作为衡量治疗药物毒副作用的指标；

本发明选择了从噬菌体环肽库中筛选出来的、能够与新生血管内皮细胞表面高效表达的整合素分子——αvβ3特异高效结合的多肽-CRGDC-(半胱氨酸-精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸-半胱氨酸)，应用基因克隆技术，构建了肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。制备出肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白，使其既具有新型重组人肿瘤坏死因子高效低毒的优点，又能在肿瘤组织新生血管处富集，从而进一步降低新型重组人肿瘤坏死因子的临床用药量，提高量效比，降低毒副作用。

                        附图说明

图1是本发明的肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合基因的全序列测定图；

PBV-CRGDC-nrhTNF测序结果为：ATG TGC CGT GGT GAT TGC GGATCC CGC AAA CGT AAG CCT GTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCTCAA GCT GAG GGG CAG CTC CAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AATGCC CTC CTG GCC AAT GGC GTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTGGTG GTG CCA TCA GAG GGC CTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTCCTC TTC AAG GGC CAA GGC TGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTCACC CAC ACC ATC AGC CGC ATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAGGTC AAC CTC CTC TCT GCC ATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAGACC CCA GAG GGG GCT GAG GCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATCTAT CTG GGA GGG GTC TTC CAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTCAGC GCT GAG ATC AAT CGG CCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAGTCT GGG CAG GTC TAC TTT GGG ATC ATT GCC TTC TGA

图2是本发明重组蛋白体内抑瘤试验中的肿瘤标本图片。图2中从上至下依次为：生理盐水阴性对照组；环磷酰胺阳性对照组；nrhTNF 120万IU/kg治疗组；RGD-nrhTNF 120万IU/kg治疗组。

                     具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。

依照本发明的技术方案制备的肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合蛋白，分别用定位基因突变技术使野生型hTNFαN端的7个氨基酸缺失，并将8、9、10位的脯氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸改为精氨酸、赖氨酸、精氨酸，同时将C端157位的亮氨酸置换成苯丙氨酸，获得新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNFα；应用基因克隆技术，构建了肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)的融合基因，并在大肠杆菌中获得高效表达。

实现本发明的肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的制备方法，按以下步骤制备：

1)分别用定位基因突变技术使野生型hTNFαN端的7个氨基酸缺失，并将8、9、10位的脯氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸改为精氨酸、赖氨酸、精氨酸，同时将C端157位的亮氨酸置换成苯丙氨酸，获得新型重组人肿瘤坏死因子nrhTNFα；

上述重组基因nrhTNFα的构建方法如下：

①采用PCR的方法，以人白细胞cDNA文库(Clontech公司)为模板，进行PCR反应获得编码野生型hTNFα的核苷酸片段，同时将EcoRI和PstI酶切位点分别引入5’端和3’端；将PCR反应产物和pGEM-3Zf(-)经EcoRI和PstI双酶切后，回收大片段，并进行连接反应。转化感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的hTNFα基因的原核克隆载体，进行DNA序列分析。测序正确者命名为pGEM-3zf(-)-hTNFα。

②采用定位基因突变技术使野生型hTNFαN端的7个氨基酸缺失，并采用PCR技术将8、9、10和157位的脯氨酸、丝氨酸、天门冬氨酸和亮氨酸，改为精氨酸、赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸。PCR反应引物设计如下：引物1为5’-CGGAATTCATGCGCAAACGTAAGCCTGTAGCCCAT-3′，其中含有一个EcoRI酶切位点，起始密码子后是Arg⁸Lys⁹Arg¹⁰的密码子，其后天然人TNFα分子第11位以后的氨基酸编码序列；引物2为5′-CGCTGCAGTCAGAAGGCAATGATCCCAAAGTA-3′，含有一个PstI酶切位点及终止密码子，将TNFα第157为Leu密码子突变为Phe密码子，其余为TNFα基因3’端互补序列。

以pGEM-3zf(-)-hTNFα为模板，以上述的引物进行PCR反应。将获得的重组质粒进行DNA序列测定，测序正确者命名为pGEM-3zf-nrhTNF，其中含有编码新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)的基因；

2)RGD-nrhTNF融合蛋白基因的克隆

按照上述方法制备的PGEM-3zf-nrhTNF质粒由本中心保存。它的克隆位点是EcoRI和PstI，我们首先设计了一对引物将5’端的EcoRI突变为BamHI。

引物1：(5’端引物，41nt)：CGGAATTC ATG CGC AAA CGT AAG CCT GTAGCC CAT GTT GTA

引物2：(3’端引物，32nt)CGC TGC AGT CAG AAG GCA ATG ATC CCA AAGTA

对p3zf-nrhTNF按下述条件进行PCR扩增：

PCR扩增反应管的组成：

                                   25μl/反应管

p3zf-nrhTNF(模板DNA，200ng/ml)     2.0

4mM dNTPS                          2.0

40mM MgCl₂                                  1.25

引物1(0.05mg/ml)                             2.5

引物2(0.05mg/ml)                             2.5

Taq酶(1.0U)                                  1.0

H2O                                          13.75

总计                                         25.0

反应管的配制均在冰浴中进行，配制过程中，先加水、模板DNA及其他反应组分，94℃反应5min，再加入Taq酶，然后进行PCR反应，PCR扩增的循环参数为：94℃，30s(变性反应)；55℃，30s(退火反应)；72℃，30s(扩增反应)，进行30次循环，于72℃延伸10min。

PCR产物用BamHI+PstI双酶切后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，回收目的片段。命名为m-nrhTNF。

按照大肠杆菌惯用密码子设计并合成了编码CRGDC导向肽的核酸片断。

片段1(28nt)：AATTC ATG TGT GAT TGT CGT GGC GAT TG

片段2(50nt)：TTT TTG TGG ATC CAC CTC TGG TTC TGG TAA ATC TTCTGA AGG TAA AGG TG

片段3(40nt)：GAT CCA CCT TTA CCT TCA GAA GAT TTA CCA GAA CCA GAGG

片段4(38nt)：TGG AGC CAC AAA AAC AAT CGC CAC GAC AAT CAC ACA TG

将合成的四个片段于65℃变性5min，退火，再与m-nrhTNF及用EcoRI+PstI处理过的pGEM3zf(-)质粒连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，应用蓝白斑筛选方法，挑取白色克隆，于LB培养液中培养过夜，提取质粒DNA，经酶切鉴定，获得插入片段大小正确的RGD-nrhTNF融合基因原核克隆载体，进行DNA序列分析。测序正确者命名为pGEM3zf-RT。其中含有编码肿瘤新生血管特异性结合多肽与nrhTNF融合蛋白的基因。

3)表达载体的构建及重组蛋白表达分析

测序正确的pGEM3zf-RT经EcoR I和PstI消化，回收约500bp的DNA片段，与经上述相同限制性内切酶处理的pBV220质粒连接，转化感受态大肠杆菌DH5α细胞，随机挑选克隆，以EcoR I和PstI双酶切鉴定、筛选。正确的克隆被命名为pBV-RT。正确重组的pBV-RT/DH5α菌，于LB中30℃活化振摇培养过夜，次日晨以1∶100比例接种LB(含Amp 100μg/ml)培养基，30℃继续培养至OD_650nm＝0.6时，迅速升高温度至42℃，培养4h。3000rpm离心15min收集菌体。经SDS-PAGE分析，发现诱导后在分子量大约18,000Dalton处有一条新生蛋白带，用鼠抗人TNF抗体为一抗，酶标兔抗鼠IgG为二抗，进行Western blot分析，证实了该新生蛋白带能够与抗TNF抗体发生特异性结合。

4)重组蛋白的纯化

按1克菌体加5-10ml裂菌缓冲液的比例将菌体重悬，用高压细胞破碎器裂解菌体，1M MgCl₂0.4ml，4℃搅拌均匀后，加入1mg/ml DNaseI 20μl，4℃搅拌l0m，12000rpm，离心15m，收集上清，加固体硫酸铵至50％饱和度，4℃静置1h，12000rpm，离心15m，收集上清。用50倍体积的A液：20mM Tris·Cl pH8.0，1mM EDTA透析过夜，中间换液三到四次。透析后的上清用A液充分平衡的Q-Sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱B液为0.3M NaCl，20mM Tris·Cl pH8.0，1mMEDTA，连续梯度洗脱10个柱床体积，收集各个洗脱峰，测定活性，取活性峰对50倍体积的C液：20mM PBpH6.0透析过夜，中间换液三到四次。透析后上清用C液充分平衡的SP-sepharose Fast Flow层析纯化，洗脱D液为20mMPB，pH6.0，1M NaCl，连续梯度洗脱4-5个柱床体积，收集洗脱峰，进行活性测定和电泳检测。

SDS-PAGE凝胶电泳检测并经凝胶成像系统分析，纯度大于95％，蛋白回收率为2.54％。

5)重组蛋白的体外生物学活性检测

肿瘤新生血管特异性结合多肽与新型重组人肿瘤坏死因子融合蛋白的生物活性检测按经典的L929细胞毒法进行。测定方法如下：

L929细胞用加有10％小牛血清的DMEM培养基培养，用胰酶消化细胞后，在显微镜下计数，调整细胞浓度为1.0×10⁵细胞/ml，并将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μl(1.0×10⁴细胞/孔)，37℃，5％CO₂培养过夜至细胞贴满板壁80％以上。

TNF标准品每个剂量各测两个孔，每孔加0.1ml，以后各孔用含3％小牛血清(FBS)的DMEM培养液做4倍梯度稀释，即标准品起始浓度为100IU/ml，以后依次为25IU/ml，6.25IU/ml，1.56IU/ml，0.39IU/ml，0.1IU/ml，0.025IU/ml，0.00625IU/ml。样品则根据实际情况预稀释至起始浓度约为100IU/ml，再做4倍梯度稀释，终体积均为100μl/孔。(以上操作均在96孔板中操作)。置于37℃，5％CO2孵箱中，培养16h。用结晶紫染色，测OD_570nm值，(双孔加样测两点值的平均)以稀释倍数的对数值为横坐标，OD_570nm为纵坐标做图，以标准品的最低OD_570nm和最高OD_570nm之平均值做一平行于X轴的直线交于曲线，以样品对应曲线与该直线交点在X轴上读出半效量的稀释度，按下式计算效价：

样品活性(IU/ml)＝标准品效价×(样品预稀释倍数/标准品预稀释倍数)×(标准品半效量稀释度/样品相当于标准品半效量的稀释度)

体外活性实验显示nrhTNF对L929细胞杀伤比活性达到1.0×10⁹IU/mgRGD-nrhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，比活性为5.6×10⁸IU/mg。

6)重组蛋白的体内活性检测

检测方法：建立小鼠S180腹水瘤移植瘤模型，以RGD-nrhTNF为受试药物，nrhTNF、环磷酰胺、注射用生理盐水为对照药物，以实验结束时小鼠移植瘤瘤体重量为检测指标，计算抑瘤率，确定受试药物的抑瘤效果；以实验前后小鼠体重为检测指标，计算体重变化率，确定受试药物的毒副反应。

实验内容：

1、受试药物：RGD-nrhTNF为冻干粉剂，保存于-20℃冰箱备用。根据用药剂量临用前于无菌条件下用生理盐水溶解、稀释。

对照药物：

①、注射用新型重组人肿瘤坏死因子半成品，使用时稀释至所需剂量。

②、环磷酰胺：选用上海华联制药有限公司生产的注射用环磷酰胺。配制成40mg/ml，4℃冰箱备用。

③、注射用生理盐水

2、实验动物：由第四军医大学实验动物中心繁育的二级昆明种小鼠，体重21克-23克，共40只，雌雄兼用，在二级饲养观察条件下进行试验。

3、实验瘤株：小鼠移植瘤瘤株，系本室定期传代的腹水瘤细胞株S180，供动物体内抑瘤实验用。

4、实验分组：将40只小鼠随机分为4组，即导向性肿瘤坏死因子RGD-nrhTNF1.2×10⁶U/kg实验组，新型人肿瘤坏死因子nrhTNF 1.2×10⁶U/kg组，环磷酰胺100mg/kg阳性对照组，生理盐水阴性对照组，每组10只动物。

5、无菌操作在小鼠右腹股沟皮下接种1×10⁷/0.1ml的S180瘤细胞。次日将接种后的动物随机分成4组，于治疗前称体重。接种瘤株后第6天分别按上述各组动物给药剂量和给药方法进行治疗，均于皮下注射环磷酰胺、导向性肿瘤坏死因子，新型重组人肿瘤坏死因子和生理盐水，连续治疗7天。末次给药后24小时，再次称量体重，然后用颈椎脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组织称其湿重，根据公式计算出肿瘤生长抑制率，并进行统计分析。

肿瘤生长抑制率可按下列公式计算：

同时按以下公式计算小鼠治疗前后体重变化率，作为衡量治疗药物毒副作用的指标。

体内试验显示RGD-nrhTNF对小鼠移植瘤S180的生长具有明显的抑制作用。RGD-nrhTNF组抑瘤率达到84.84％，与对照组有明显差异(P＜0.01)。与相同剂量的nrhTNF(肿瘤抑制率为59.09％)相比，疗效具有明显差异。且毒副作用有低于相同剂量的nrhTNF的趋势。

表1是RGD-nrhTNF在纯化过程中的活性检测结果，表2是重组蛋白的抑瘤效果。

         表1：RGD-nrhTNF在纯化过程中的活性检测结果

  活性(IU/ml)  体积(ml)  蛋白含量(mg/ml)  比活(IU/mg)  总蛋白(mg)  蛋白回收率(％)  裂菌上清  5×10⁶  120  0.856  5.85×10⁶  102.72  Qp1  6.4×10⁶  110  0.411  1.56×10⁷  45.21  44.01  Sp峰  5×10⁷  30  0.088  5.6×10⁸  2.64  2.54

       表2  RGD-nrhTNF对小鼠移植瘤S180的抑制作用

  组别肿瘤抑制率％  剂量  动物数(只)  平均瘤重mg±SD  实验对照组环磷酰胺组71.21^**RGD-nrhTNF84.84^**nrhTNF59.09^**  生理盐水0.2ml100mg/kg120万IU/kg120万IU/kg  10101010  132±7238±2120±1854±18

^**：表示与阴性对照组差异显著(P＜0.01)

具体实施例：

申请人选用了能特异性与αvβ3整合素结合的含五个氨基酸的环肽CGRDC，应用基因重组的方法，将其与nrhTNF氨基端融合，并在大肠杆菌中获得表达。在成功构建、表达融合基因的基础上，参照nrhTNF的纯化方法，建立了成本低廉的纯化工艺。在体外杀伤试验中，该融合蛋白RGD-nrhTNF对L929细胞具有剂量依赖性的、明显的杀伤作用，比活性达到5.7×10⁸IU/mg。在动物肿瘤模型中，该融合蛋白RGD-nrhTNF对小鼠S180腹水瘤有显著的抑制作用(肿瘤抑制率为84.84％)，明显高于相同剂量的nrhTNF(肿瘤抑制率为59.09％)。并且毒副作用低于nrhTNF。虽然我们还没有直接的证据证实RGD-nrhTNF在体内可以将新型重组人肿瘤坏死因子富集于肿瘤新生血管部位，但已初步证明了改造后的RGD-nrhTNF疗效提高，毒副作用降低。具体实验方法及结果如前所述。

经实验证明，本发明的效果如下：

1)利用PCR的方法成功的改造了nrhTNF5’端酶切位点，并将人工合成的编码CRGDC的寡核苷酸片段与nrhTNF5’端连接，构建了RGD-nrhTNF融合基因的克隆载体pGEM3zf-RT，DNA序列测定证实完全正确。

2)构建了RGD-nrhTNF融合基因的原核表达载体pBV-RT，经温度诱导，在大肠杆菌中获得高效表达。经免疫印迹证实该融合蛋白与抗TNFα抗体有特异性结合能力。

3)纯化了RGD-nrhTNF融合蛋白。SDS-PAGE凝胶电泳检测纯度大于95％。蛋白回收率为2.54％。

4)体外活性实验显示RGD-nrhTNF融合蛋白对L929细胞有明显的杀伤活性，比活性达到5.6×10⁸IU/mg。体内试验显示RGD-nrhTNF对小鼠移植瘤S180的生长具有明显的抑制作用。RGD-nrhTNF组的抑瘤率达到84.84％，与对照组有明显差异(P＜0.01)。与相同剂量的nrhTNF(肿瘤抑制率为59.09％)相比，疗效具有明显差异。且毒副作用有低于相同剂量的nrhTNF的趋势。

肿瘤新生血管特异性结合多肽CRGDC与新型重组人肿瘤坏死因子(nrhTNF)融合基因的全序列：

ATG TGC CGT GGT GAT TGC GGA TCC CGC AAA CGT AAG CCTGTA GCC CAT GTT GTA GCA AAC CCT CAA GCT GAG GGG CAG CTCCAG TGG CTG AAC CGC CGG GCC AAT GCC CTC CTG GCC AAT GGCGTG GAG CTG AGA GAT AAC CAG CTG GTG GTG CCA TCA GAG GGCCTG TAC CTC ATC TAC TCC CAG GTC CTC TTC AAG GGC CAA GGCTGC CCC TCC ACC CAT GTG CTC CTC ACC CAC ACC ATC AGC CGCATC GCC GTC TCC TAC CAG ACC AAG GTC AAC CTC CTC TCT GCCATC AAG AGC CCC TGC CAG AGG GAG ACC CCA GAG GGG GCT GAGGCC AAG CCC TGG TAT GAG CCC ATC TAT CTG GGA GGG GTC TTCCAG CTG GAG AAG GGT GAC CGA CTC AGC GCT GAG ATC AAT CGGCCC GAC TAT CTC GAC TTT GCC GAG TCT GGG CAG GTC TAC TTTGGG ATC ATT GCC TTC TGA