分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体融合蛋白的生物活性的预测及分析

摘要

目的：利用生物信息学网络资源分析融合蛋白的二级结构及其理化性质，进一步构建分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因，探讨分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因表达并分泌针对成骨肉瘤细胞的靶向性ScFv-TNF融合蛋白。 方法：融合蛋白的亲和性及抗肿瘤活性分别较衍生因子的功能及活性有所变化，可能由于融合蛋白结构变化导致功能及活性的变化，抗体融合的重组设计实际上只受想象和能够产生正确折叠蛋白产物的表达系统的限制。我们在构建融合蛋白时，选用了通用酶切位点序列，然后运用DNA分析软件(DNAssist)和蛋白质分析软件(ANTHEPROTV5)分析预测融合蛋白的氨基酸序列、二级结构及其理化性质。首先采用PCR方法将人工合成的抗体分泌信号肽序列加在抗骨肉瘤ScFv(singlechainvariableregionfragmentsantibody)基因5'端，其3'与人的肿瘤坏死因子TNF基因连接构成分泌型单链双功能抗体ScFv-TNF基因，将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN，构建抗骨肉瘤单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体pL(ScFv-TNF)SN，重组质粒pL(ScFv-TNF)SN在脂质体介导下转染PA317包装细胞，G418筛选，直至出现抗性克隆，扩大培养，用NIH3T3测定病毒滴度，将重组病毒感染人骨肉瘤OC9901细胞，G418筛选出抗性克隆，命名为OC/ScFv-TNF,以PCR，RT-PCR以及Westernblotting对ScFv-TNF基因修饰的OC9901细胞进行鉴定。 结果：通过重组PCR方法在编码ScFv与TNF的碱基之间引入酶切位点获得的DNA序列，运用DNAssist核酸序列分析软件分析ScFv-TNFDNA序列翻译并获得了氨基酸序列及其开放性阅读框架，并运用蛋白质分析软件(ANTHEPROTV5)分析融合蛋白的二级结构，分析融合蛋白的理化性质及其潜在的信号肽与断裂位点。构建完成的逆转录病毒表达载体pL(ScFv-TNF)SN，首先用EcoRI和BamHI双酶切下930bp左右的片段，符合ScFv-TNF片段大小，pL(ScFv-TNF)SN进一步EcoR1和Xho1及Xho1和BamH1分别双酶切鉴定，分别切下470bp左右及460bp左右的片段，符合TNF及ScFv片段大小。经测序，限制性酶切分析及PCR方法鉴定，各插入基因序列的大小，位置及其方向均正确无误，成功地构建了不同基因组合的瞬时表达载体pEGFP-ScFv-TNF。构建了融合不同基因表达载体pL(ScFv-TNF)SN；获得高滴度产毒细胞株C26，滴度分别为6×108CFU/L；PCR，RT-PCR及Westernblotting分析证明ScFv-TNF基因已整合至OC9901细胞基因组中，并在mRNA水平上表达。 结论：探讨分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因表达并分泌针对骨肉瘤细胞的靶向性ScFv-TNF融合蛋白以及利用生物信息学网络资源探讨和分析融合蛋白的二级结构，理化性质及其潜在的信号肽与断裂位点的信息。为进一步构建分子量尽可能小，免疫原性尽可能弱的分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因，采用PCR方法在抗骨肉瘤ScFv的5'端加上引导序列、3'端连上人的肿瘤坏死因子TNF基因，构建成功了分泌型抗骨肉瘤单链双功能抗体基因，并将该基因克隆至逆转录病毒表达载体PLxSN，构建抗骨肉瘤单链双功能抗体基因逆转录病毒表达载体pL(ScFv-TNF)SN。生物信息学可以促进药物的发现和开发过程，即充分利用生物信息学的生物学和遗传学信息来寻找和开发以基因为基础的药物。各融合蛋白的研究成果，可见决定融合蛋白的生物活性的主要因素可能包括：①衍生因子的空间位置，取决于衍生因子蛋白的活性功能域；②衍生因子各自的受体结构及相互关系；③中间接头的大小和复杂性，以及其他可能影响蛋白空间结构的各种因素。具有不同功能域的复合蛋白质是今后寻找新的治疗因子的有效途径和研究方向。探讨集免疫、基因治疗和靶向治疗为一体的一种新的治疗骨肉瘤方法。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

第一章文献回顾

第二章生物信息学的网络资源在ScFv-TNF分子生物活性中的分析预测

第三章ScFv与TNF融合基因逆转录病毒载体的表达

第四章ScFv-TNF分泌型单链双功能抗体分子间接头的设计及软件分析

参考文献

个人简历及攻读学位期间研究成果

致谢