重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓造血损伤修复作用初探

摘要

骨形成蛋白(BoneMorphogeneticProteins，BMPs)是一种分泌型糖蛋白，具有多种生物学功能。BMP2和BMP4是骨形成蛋白家族中的两个重要成员，在结构和功能上这两种蛋白都非常相似，两者都能够诱导骨组织的生成和造血组织的分化等，但BMP2诱导骨组织形成的活性更强，BMP4则对造血组织的作用更突出。在成体，BMP2诱导异位骨形成，成为用于骨组织工程的重要诱导因子；BMP4则可以促进造血干细胞的增殖，并诱导造血干细胞向红系、粒系和巨噬细胞系三系细胞分化，从而能够促进受损伤的造血系统的全面再生与恢复；这些特性使得BMP2和BMP4都具有很好的临床应用前景。 在BMP的制备过程中，真核表达系统表达量低，表达产物回收、纯化困难、生产成本很高；原核表达系统，特别是大肠杆菌系统，具有表达效率高，容易操作，容易监控，产物稳定，生产成本低等优点，故而我们在进行BMP的大规模制备过程中选择了大肠杆菌表达系统。目前，重组人骨形成蛋白2的大规模制备已有较多报道，本研究的目的，就是应用我们目前已经比较成熟的制备BMP2的工艺，来制备BMP4，来验证大规模制备这两种蛋白时，能否用相同的发酵程序及相近的纯化方法。 两种工程菌株(DH5α/pDH2-BMP-4m及DH5α/pDH2-BMP-2m)分别含有能够高表达人骨形成蛋白成熟肽(Bonemorphogeneticproteinmaturepeptide，hBMP-m)hBMP-4m和hBMP-2m的质粒，分别导入15升NBS发酵罐中进行恒溶氧高密度发酵和诱导表达，测定发酵菌液OD600值分别为30.8和32.3。离心收集菌体，PAGE电泳后光密度扫描表明hBMP-4m占细菌总蛋白量的42％，hBMP-2m占细菌总蛋白量的47.2％。悬浮所收集的菌体，裂菌，洗涤4次后的包涵体中hBMP-4m占蛋白量的82.9％，hBMP-2m占蛋白量的84.5％。预先取少量样品进行探索实验后，全部包涵体分别用8M尿素缓冲液溶解，上SepharoseSP-FF阳离子柱，分别收集0.35MNaCl和0.2MNaCl洗脱部分，获得纯度为96％的hBMP-4m及纯度为95％的hBMP-2m。其收获量分别为1.3g/L发酵液和1.25g/L发酵液；收得率分别为34.33％和34.81％。结果表明大规模制备hBMP-4m,及hBMP-2m时，可以使用相同的发酵程序及相近的纯化方法，都能够得到较好的收得率、较高的收获量和纯度。 将经过上述大规模制备的rhBMP-4m和rhBMP-2m在不使用任何吸附载体的情况下、分别直接植入小鼠肌肉中，结果都在局部生成骨组织，这整体动物试验证实两者都是具备成骨活性的，这更进一步证明了我们的制备及纯化方法是行之有效的。在动物试验过程中，rhBMP-4m和rhBMP-2m表现出了不同程度的诱导骨形成的能力，其中，rhBMP-2m的诱骨能力最强，第2周就有骨小梁形成；而rhBMP-4m的成骨能力较弱，至第4周方始形成软骨。 BMP4已被证实是一种造血调控因子，有研究指出，其在低浓度时可促进造血干细胞的增殖和分化，高浓度时则可促进造血干细胞再生能力的提高，从而促骨髓增殖能力更持久，说明BMP4对造血干细胞的存活有直接影响。 骨髓造血细胞对射线敏感，辐射能够直接致死骨髓造血细胞或诱导骨髓造血细胞发生凋亡，引起造血干细胞数量下降。CD34抗原是是一种阶段特异性白细胞分化抗原，选择性表达于人类造血干细胞、祖细胞和血管内皮细胞表面。CD34+细胞则是非均质的细胞群，其中既含有造血干细胞也存在不同分化阶段的造血祖细胞。因此，CD34表面抗原的检测是能够反映骨髓造血的状况的指标之一，对造血干细胞的确认、计数、分离和控制具有重要价值。已有实验证实BMP2能够提高辐射小鼠的存活率，并对辐射小鼠骨髓造血功能的恢复具有促进作用；但是BMP4对辐射小鼠是否具有类似作用，目前尚无报道，本实验观察重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓造血功能的促进作用，为骨形成蛋白治疗辐射引起的骨髓造血损伤提供一定的依据。 1.建立小鼠骨髓型急性放射损伤的动物模型，分离和纯化骨髓单个核细胞，确定本课题研究的基本方法。通过60Coγ射线照射昆明小鼠，照射剂量7Gy，吸收剂量率为1.45Gy/rain，建立小鼠骨髓型急性放射损伤的动物模型；制备骨髓细胞悬液，利用Ficoll密度梯度离心法，分离、纯化骨髓单个核细胞，统计细胞数量的变化。结果，小鼠受到辐射后，骨髓单个核细胞数与正常组相比，有非常显著的差别(P＜0.01)，经重组人骨形成蛋白成熟肽-4治疗后，骨髓单个核细胞数高于照射组(P＜0.05)。 2.重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠外周血白细胞变化的影响。小鼠受到60Coγ射线照射后，经rhBMP-4m治疗，检测外周血白细胞数。结果：辐射后小鼠外周血白细胞数与正常组相比，有非常显著的差别(P＜0.01)，经重组人骨形成蛋白成熟肽-4治疗后，外周血白细胞数高于照射组(P＜0.01)。 3.重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠骨髓CD34+细胞变化的影响。小鼠受到60Coγ射线照射后，经rhBMP-4m治疗，利用流式细胞仪(FCM)，检测骨髓单个核细胞中CD34+细胞比例，比较对照组和治疗组之间的差别。结果：骨髓单个核细胞中CD34+细胞所占比例明显低于正常组(P＜0.01)：经重组人骨形成蛋白成熟肽-4治疗后，骨髓单个核细胞中CD34+细胞所占比例高于照射组(P＜0.05)。 4.重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠脾脏表面CFU-S形成的影响。小鼠受到60Coγ射线照射后，经rhBMP-4m治疗后，于第9天解剖并取出其脾脏组织，用固定液固定24h后，观察其脾脏表面，发现治疗组脾脏表面生成有较多的结节(CFU-S)，而对照组很少。结果：治疗组小鼠脾结节数及脾体比均明显高于对照组(P＜0.01)。 5.重组人骨形成蛋白成熟肽-4对辐射小鼠30天存活率的影响。小鼠受到60Coγ射线照射后，rhBMP-4m治疗组30天存活率为35％；而对照组存活率仅10％。治疗组明显高于对照组。 本课题的实验结果表明，小鼠经60Coγ射线照射后，骨髓造血功能受到损伤，通过重组人骨形成蛋白成熟肽-4治疗，能够促进骨髓单个核细胞数量的恢复，增加骨髓中CD34+细胞的数量，并促进小鼠脾脏CFU-S的形成，显示其能够改善骨髓造血的状况，促进造血细胞的增殖，加快骨髓造血功能的恢复，故而有可能缩短骨髓造血系统重建所需的时间。这些试验结果提示我们，在治疗辐射损伤或是其它相关血液系统的疾病时，可以考虑这种新的造血调控因子，与现有治疗手段结合，从而开创新的治疗思路。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

文献回顾

正 文

1大肠杆菌表达的重组人BMP-2和hBMP-4成熟肽大规模发酵和纯化方法的比较

2大肠杆菌表达的基因重组人骨形成蛋白2成熟肽及人骨形成蛋白4成熟肽复性后诱导小鼠肌肉成骨

3重组人骨形成蛋白成熟-4对辐射小鼠骨髓造血损伤修复作用初探

小 结

参考文献

个人简历及研究成果

致 谢