纳米粒子介导血管内皮生长因子基因治疗兔心肌缺血的疗效

摘要

实验背景:应用血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)基因转染治疗缺血性心脏病，在国内外已研究多年，并取得初步有效的临床试验结果。在相关的大多数临床试验中采用的基因载体是裸质粒或病毒载体，裸质粒介导基因转染效率低，易被体内核酸酶降解，外源基因表达时效短；病毒载体如腺病毒转染效率高，但存在着免疫反应的危险。因此继续寻求安全、有效的基因传递系统是其研究领域的一个重要方面。 近年来，纳米级聚合物粒子开始用于基因的传递，实验已证实纳米粒子包裹寡聚核苷酸后，可增加寡核苷酸进入细胞内的量；同时增加寡核苷酸对抗核酸酶的能力，防止寡核苷酸的降解，增强其在细胞内的稳定性。同时纳米粒子因其良好的组织穿透能力，极易被细胞吸收以及所具有的控释效应，使之在血管疾病的治疗中有着潜在的不可比拟的优越性。 目的: 1.制备VEGF基因纳米粒子并观察其一般性状。 2.VEGF基因纳米粒子体外转染心肌细胞的实验研究。3.心肌细胞吞噬VEGF基因纳米粒子的形态学研究。 4.VEGF基因纳米粒子对心肌缺血的疗效观察。 方法1.制备VEGF基因纳米粒子向聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLGA)二氯甲烷溶液中加入浓度为10mg/ml的pcDNA3.1/VEGF165质粒1ml，高速搅拌至油包水乳液；再加入1.0％聚乙烯醇(PVA)水溶液继续搅拌成水/油/水复乳液；旋转蒸发仪减压蒸去二氯甲烷；4℃，10000r/min离心10min，加蒸馏水离心清洗3次；取上清液进行DNA包封率的计算，收集沉淀冷冻干燥，备用。测定其载药量、体外释放情况及粒径。 2.VEGF基因纳米粒子转染心肌细胞培养乳鼠心肌细胞，传代后按2×105个细胞/孔，接种于24孔板中，培养48h，使达到80％融合。于6个孔中加入VEGF165基因纳米粒子；6个孔中加入VEGF165裸质粒；6个孔为空白对照组，培养48h。应用RT-PCR法检测VEGFmRNA水平，应用ELISA法检测VEGF蛋白表达水平，观察纳米基因载体为真核细胞传递基因的可行性。 3.心肌细胞吞噬VEGF基因纳米粒子的形态学研究制备纳米粒子悬浮液，采用成年新西兰兔4只，3％戊巴比妥纳(1ml/kg)经耳缘静脉麻醉，逐层暴露心脏。用微量注射器直视下向心肌内注射VEGF165基因纳米粒子悬浮液0.8ml。96h后心肌注射部位取材，固定切片，透射电镜下观察。评价其向心肌组织内传递基因的可行性。 4.VEGF基因纳米粒子对心肌缺血的疗效观察。建造兔急性心肌缺血模型，随机分为三组，纳米粒子组(n=12)心肌内注射VEGF165纳米粒子，裸质粒组(n=12)注射VEGF165裸质粒，对照组(n=8)注射生理盐水。术后1月对实验动物进行心脏超声检查，观察心功能改善情况，取注射部位的心肌组织，Ⅷ因子相关抗原染色，观察心肌组织中毛细血管生成情况。 结果: 1.成功制备VEGF165基因纳米粒子(1)包封率为：88.4％。(2)载药率为：1.87％。(3)体外测定DNA释放情况为：最初24h有24.9％/24h±4.3％/24h(n=4)的DNA被释放出来，随后的4d内以7.2％/24h±2.3％/24h的速率释放，然后维持1.6％/24h±0.5％/24h的速率释放，持续观察14d后DNA释放终止。(4)电镜观察纳米粒子的粒径在50-300nm之间。 2.VEGF165基因纳米粒子可体外转染心肌细胞RT-PCR结果显示纳米粒子组可见特异性条带，裸质粒组、对照组无此特异性条带，这说明纳米粒子可将VEGF基因导入心肌细胞。ELISA法检测结果显示，纳米粒子组的细胞上清中VEGF蛋白质量浓度为385ng/l±46ng/l，而裸质粒组与空白对照组则未检测到VEGF蛋白。 3.心肌细胞内可见被吞噬的纳米粒子心肌细胞胞质内及胞核内可见大量被吞噬的纳米粒子，部分位于线粒体间或吸附于线粒体膜上。部分纳米粒子位置靠近核膜或附于核膜上，并且有些已被核膜包裹。 4.VEGF基因纳米粒子治疗心肌缺血的疗效术后1月纳米粒子组较其它两组在室壁运动及左室射血分数改善明显，具有统计学意义。纳米粒子组、裸质粒组及对照组心肌内毛细血管数分别为(57±12)、(41±14)及(24±8)，各组之间差异均有统计学意义(P均＜0.05)。 结论:成功构建了VEGF165基因纳米粒子，纳米粒子可用于VEGF165基因的携带、转染和表达，体内实验证实心肌细胞完全可以通过吞噬方式大量摄取VEGF165纳米粒子，VEGF165纳米粒子做为向心肌细胞转运的基因的载体是可行的，与裸质粒介导的基因转染相比，VEGF165基因纳米粒子对心肌缺血模型的室壁运动幅度、左室射血分数改善更加明显，心肌内毛细血管生成更多。

目录

缩略语表

文献回顾

第一部分 VEGF165基因纳米粒子的制备

第二部分 纳米粒子介导VEGF165基因转染心肌细胞

第三部分 心肌细胞吞噬VEGF165基因纳米粒子的形态学实验

第四部分 纳米粒子介导VEGF165基因治疗心肌缺血的疗效

小 结

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致 谢