反转录病毒载体介导人血管内皮生长因子基因治疗实验性兔脑缺血

摘要

目的:探索人血管内皮生长因子基因治疗脑缺血的可行性。方法:实验于2005-03/12在上海交通大学医学院附属瑞金医院神经病学研究所完成。实验动物选择新西兰大白兔30只,随机分为反转录病毒-血管内皮生长因子实验组和对照组,每组15只,建立兔脑缺血模型,构建含人血管内皮生长因子基因的逆转录病毒表达载体,对兔脑缺血模型进行基因治疗。术后12h和24h取实验动物脑组织,免疫组化方法检测人血管内皮生长因子蛋白的表达,原位杂交检测人血管内皮生长因子mRNA的表达,碱性磷酸酶法(X-p染色)检测毛细血管密度,并通过新生血管计数观察其促血管生成作用。运用反转录-聚合酶链反应检测反转录病毒在脑缺血兔各脏器的分布及人血管内皮生长因子的表达。结果:注射反转录病毒后,实验组有效表达人血管内皮生长因子,琼脂糖凝胶电泳结果显示人血管内皮生长因子165片段大小约560bp,经过ECORI和HindⅢ双酶切后产生2个片段分别为5.4bp和560bp,经测序证实无突变。实验组脑组织表达血管内皮生长因子蛋白。Westernblot结果也显示注射部位的脑组织中血管内皮生长因子蛋白含量明显高于对照组。60个G418抗性细胞集落,培养最高为3.2cfu/L,在32℃的条件下培养48h获得3×10cfu/L的滴度。实验组半暗带区脑组织中毛细血管密度显著增加。在肺、肝、脾、肾、睾丸组织中均未检测到人血管内皮生长因子基因的表达。结论:反转录病毒介导人血管内皮生长因子基因治疗脑缺血,能有效表达人血管内皮生长因子,促进半暗带区毛细血管增生。