腺病毒介导的基因修饰树突状细胞肝癌瘤苗的制备及其抗HBV相关肝癌的免疫实验的研究

摘要

目前DC在抗肿瘤免疫治疗方面的研究已经取得一些进展，并且在肿瘤的临床治疗上已显示其良好的治疗效果。但是由于大多数肿瘤来说，肿瘤组织中仅部分肿瘤细胞表达一种肿瘤相关抗原，针对单一肿瘤相关抗原的免疫应答无法清除所有肿瘤细胞。并且肿瘤细胞本身存在多种肿瘤相关抗原，针对单一抗原的免疫治疗有时并不能发挥其应有的作用，激发的免疫效应弱。故近来为使DC能够负载更多肿瘤抗原，发挥更大免疫治疗效应，人们研究了DC负载多种抗原的制备方法，包括：经照射的肿瘤细胞与DC共培养，肿瘤细胞来源的RNA转染DC，腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC以及多种肿瘤相关抗原肽冲击致敏DC等方法。在这些方法中以肿瘤细胞来源的RNA转染DC以及腺病毒介导多种肿瘤相关抗原感染DC最为有效，但肿瘤细胞来源的RNA具有生物活性不稳定等缺点。因此，在本研究中，我们根据中国人原发性肝癌独有的流行病学特点，应用HBV相关性肝癌中HBV病毒特异性抗原，联合肝癌相关抗原AFP作为免疫治疗靶点，制备AFP、HBsAg基因的腺病毒载体，体外转染人树突状细胞，比较HBsAg- DC 、AFP-DC以及AFP / HBsAg-DC瘤苗体外对HBsAg表达的人肝癌细胞株的杀伤活性。探讨腺病毒介导的HBsAg、AFP基因共感染较单基因感染DC能否增强其体外诱导的特异性抗肿瘤免疫效应，以期选择更为有效的DC肝癌瘤苗，为原发性HBV感染肝癌的治疗寻求新的途径。 第一部分：HBsAg、AFP基因重组腺病毒表达载体的构建及鉴定 目的:构建能高效转导HBsAg、AFP基因的重组腺病毒，进行病毒扩增和滴度测定，并检测HBsAg、AFP抗原表达，以用于DC基因治疗的实验研究。 方法:应用Adeno-XTM腺病毒表达载体系统分别构建表达AFP、HBsAg的重组腺病毒和对照载体Ad-GFP。目的基因首先克隆到pShuttle形成穿梭载体，用PI-Sce Ⅰ和I-CeuⅠ双酶切后将所获HBsAg、AFP基因片段再与线性化的腺病毒载体Adeno-X连接,形成重组腺病毒质粒，再以PacⅠ酶切线性化，转染HEK293细胞包装为重组腺病毒。检测病毒滴度后，进一步对重组腺病毒分别感染HEK293和H1299细胞的结果进行IFA法检测目的基因在靶细胞中的有效表达。 结果:经酶切、PCR鉴定证实，穿梭质粒和重组腺病毒质粒插入片段为HBsAg、AFP基因。包装的腺病毒载体具有良好的感染性，可以在293细胞中形成病毒颗粒。滴度测定结果为Ad-S 2.65×109 PFU/ml；Ad-AFP采用同样方法测定的滴度为3.16×109 PFU/ml。重组腺病毒感染H1299细胞后IFA法检测结果显示目的基因表达于感染细胞中，表明腺病毒介导的HBsAg、AFP基因感染的有效性。 结论:成功构建了复制缺陷型AFP、HBsAg重组腺病毒及对照重组腺病毒Ad-GFP；重组腺病毒Ad-S、Ad-AFP能高效介导基因在被感染细胞内有效表达。 第二部分：树突状细胞的体外诱导及其体外感染腺病毒效率的测定 目的:以经动员富集的肝癌患者外周血单个核细胞（Mono nuclear cell，MNC）为来源，建立体外诱导培养DC的方法；以健康供者MNC为对照，检测肝癌DC的形态、表型及功能；利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率。 方法:选择肝癌患者及正常人外周血，血细胞分离机分离富集外周血MNC，经淋巴细胞分离液梯度离心、聚苯乙烯细胞培养板贴壁纯化后，加入含GM-CSF和IL-4的X-VIVO 15培养液联合诱导DC分化，诱导d6加入TNF-α促进DC成熟。分别以倒置显微镜、电子显微镜观察DC形态变化，FCM检测细胞表型变化。利用Ad-GFP作为研究对象，测定腺病毒介导的树突状细胞的体外转染效率，MTT法检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力。取培养第7天的DC，按不同的MOI将重组腺病毒加入培养孔中，FCM检测细胞感染前后的表型变化以及腺病毒的感染效率。 结果:肝癌患者DC鉴定：诱导后，患者DC显示出典型的形态及表型特征。诱导d8(加TNF-α活化48h)，各抗原表达量明显升高，分别为：CD1a( 71.45士4.39)％、CD11c( 89.68士3.16)％、CD86(91.17士4.43)％、CD80 ( 91.37士4.12)％、HLA-DR( 94.03士3.01 )％，为典型DC表型；健康对照DC各抗原表达量为CD1a( 68.45士5.02)％、CD11c( 91.09士2.01)％、CD86(92.19士4.36)％、CD80 ( 90.81士3.15)％、HLA-DR( 93.49士4.18 )％，二者间无显著性差异(P>0.05 )。混合淋巴细胞反应结果显示，患者DC具有高效地刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力，其刺激指数( SI)与健康对照DC的SI无显著差异(P>0.05 )。用Ad-GFP感染培养的DCs时，有较好的量效关系和时效关系。当感染增殖率(multiplicity of infection, MOI)为100时，感染24小时接近80.62％的DCs被转染。且转染后的DCs的形态与对照组相比无明显异常。当MOI为100，感染48小时后接近85.25％的DC被转染。并且DC经腺病毒感染DC 48小时后，FCM检测细胞表型为成熟DC表型特征。证明Ad-GFP能高效、安全感染培养的DC。 结论:以肿瘤患者经动员富集的外周血MNC为来源，联合应用GM-CSF、IL-4及TNF-α，在体外可诱导培养出具有典型形态、表型及免疫活性的DC。腺病毒介导的基因可感染人外周血MNC来源的DC可高效表达。 第三部分：重组腺病毒介导HBsAg和AFP基因修饰树突状细胞体外诱导抗HBV相关肝癌免疫实验的研究 目的:以腺病毒载体介导AFP基因与HBsAg基因修饰树突状细胞，使之作为抗原呈递细胞，同时呈递HBV肝癌相关抗原AFP和HBsAg，从而诱导更强的特异性CTLs，即可对恶性肿瘤细胞发挥杀伤效应，又可诱导抗HBV免疫的作用。并探讨AFP、HBsAg基因修饰树突状细胞较单基因修饰DC瘤苗作为HBV持续感染的肝癌免疫治疗是否更具优势。 方法:分别以Ad-S、Ad-AFP以及Ad-S和Ad-AFP转染DC，以IFA 法检测三组细胞抗原表达，以FCM检测感染后DC表型变化。以S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC作为刺激细胞，取患者外周静脉血单个核细胞(PBMC )中非贴壁细胞(淋巴细胞，L)，调整细胞密度为1 ×106/mL，以含1L-2，10％FCS的RPMI1640培养；将S-DC、AFP-DC与S/AFP-DC以5×104mL密度分别加入上述淋巴细胞中，共同孵育72h (设未致敏DC组和单独淋巴细胞组为对照)，再次加入同剂量DC孵育72h，收获细胞分别称为S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L。以S/AFP-DC-L、AFP-DC-L、S-DC-L、DC-L和L作为效应细胞，肝癌细胞株HepG2.2.15，SMMC-7721和人肺腺癌H1299作为靶细胞，以不同效靶比接种于96孔板，4h后LDH法测定效应细胞对各肿瘤细胞的杀伤作用。 结果:IFA法检测结果显示目的基因均表达于转染的三组细胞中。FCM结果显示共感染的DC细胞均高表达CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR，表现为成熟DC表型特征。CTL结果显示S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L组均显示对HepG2.2.15高效特异的杀伤活性，显著高于DC-L组和单纯L组，其杀伤能力与效应细胞数量成正比；在同一效靶比时S/AFP-DC-L对HepG2.2.15的杀伤率明显高于S-DC-L、AFP-DC-L组；而S-DC-L、AFP-DC-L组对HepG2.2.15的杀伤率无明显区别；S/AFP-DC-L、S-DC-L、AFP-DC-L刺激的T细胞组IFN-γ分泌显著高于DC刺激的L细胞组和L细胞组；但S/AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌显著高于S-DC-L、AFP-DC-L组；而S-DC-L、AFP-DC-L刺激组IFN-γ分泌无明显区别；对照组DC-L和L组IFN-γ分泌亦无明显区别。 结论:腺病毒介导AFP和HBsAg基因修饰DC，能够在体外诱导特异性CTL效应，对表达HBsAg的肝癌细胞有明显的杀伤作用，而且对HepG2.2.15细胞杀伤率大于单独转基因者。