肝细胞中结合丙型肝炎病毒C区RNA的特异性蛋白分子筛选、鉴定和表达研究

摘要

目的和意义: 丙型肝炎病毒（HCV）是慢性肝炎和肝癌的主要病原体之一，但对于HCV 的复制和致病机制目前还是不甚清楚。宿主细胞中的许多蛋白分子可以通过与HCV RNA 基因组的相互作用，调节HCV 的翻译、复制和病毒的组装。 现有研究发现的HCV RNA 结合蛋白，其结合区域主要位于HCV RNA 的5’-UTR、3’-UTR 和RNA 的副链。但是与HCV CORE 区（核心区）RNA 结合的细胞蛋白却很少有研究报导。本研究拟采用凝胶迁移和紫外交联的实验方法，从人肝癌细胞系HepG2 细胞中初步筛选与HCV CORE 区RNA 结合的细胞蛋白分子，确定其与HCV RNA 结合的具体区域，并对RNA 结合蛋白进行分离、鉴定。通过研究宿主细胞蛋白与HCV C 区RNA 的相互作用，将有助于我们对宿主和病毒相互作用的更好理解，从而在细胞蛋白质水平对病毒RNA 的翻译、复制和病毒蛋白表达进行调控；并有利于在丙型肝炎的预防和治疗方面提出针对性的措施。 方法: ①采用RT-PCR扩增HCV C 区cDNA序列，并构建重组质粒pGEM-HCV；以pGEM-HCV 为模板，采用体外转录的方法制备DIG 标记和未标记的HCVC-RNA 分子；将DIG 标记的HCV C-RNA 与HepG2 细胞蛋白结合，进行凝胶迁移实验；将DIG 标记的HCV C-RNA 与HepG2 细胞蛋白结合，进行紫外交联筛选实验，并采用未标记的HCV C-RNA 分子进行竞争性实验；电泳后将RNA/蛋白转移至NC 膜，以DIG 抗体检测NC 膜上的DIG 信号，判断是否有细胞蛋白与HCV C-RNA 结合。 ②采用PCR、克隆和体外转录的方法，制备不同长度的HCV C-RNA 分子；分别将不同长度的HCV C-RNA 分子与细胞蛋白进行结合反应和紫外交联实验，确定HCV C-RNA 与细胞蛋白的结合区域；采用抗-DIG 和免疫沉淀方法，从RNA 和蛋白混合物中，分离与DIG 标记的HCV C-RNA 分子结合的细胞蛋白；通过SDS-PAGE 和NC 膜的检测结果的比对，切取目的蛋白条带，进行肽指纹图谱分析鉴定。 ③提取HepG2 细胞总RNA，以RT-PCR 方法扩增PGAM-B 的全基因片断，与载体pcDNA?3.1/V5-HisA 连接，构建真核表达质粒pcDNA-PGAM； 以PCR 方法扩增pGEM-HCV 中HCV 核心蛋白基因片断，与载体pcDNA3.0连接，构建真核表达质粒pcDNA-HCV；经酶切和测序鉴定后，将真核表达质粒分别转染HepG2 细胞；以免疫细胞化学的方法，在细胞爬片上分别检测细胞中PGAM-His 蛋白和HCV 核心蛋白的瞬时表达情况。 结果: ①从1 例HCV 感染者血清中扩增得到的503bp HCV cDNA 序列，构建了重组质粒pGEM-HCV，并进行了PCR、酶切鉴定和测序鉴定。②所得HCVcDNA 序列与已知HCV 序列（AB092962.1）比较，属于HCV 1 型基因C 区，仅有两个核苷酸不同，nt 67（23aaK→E）和nt 177（沉默突变），其余序列均一致。③通过凝胶迁移实验初步检测到，有HepG2 细胞蛋白与HCV C-RNA分子结合。④通过紫外交联实验检测到，有多个HepG2 细胞蛋白与HCVC-RNA 分子在体外发生了结合；随着结合反应体系中细胞蛋白浓度的增加，HCV C-RNA 和蛋白的结合量随之增多；未标记HCV C-RNA 对DIG 标记的HCV C-RNA 与HepG2 细胞蛋白的结合有竞争性抑制作用。⑤3 个不同长度的HCV C-RNA 分子（198nt、306nt 和503nt）都可与HepG2 细胞蛋白在体外发生结合；其中C-RNA 5’端的C198 RNA 与细胞蛋白的结合条带，最为清晰和锐利。⑥经免疫沉淀后的蛋白，在NC 膜上可以检测到4 条明显的兰紫色RNA 结合蛋白带；其中以P30 蛋白条带最为清晰，蛋白量最多。⑦从SDS-PAGE 胶上切取了P30 蛋白条带，经肽指纹图谱分析鉴定，P30 蛋白为磷酸甘油酸变位酶1（PGAM-B）。⑧从HepG2 细胞中，扩增得到了约为760bp的PGAM-B 的cDNA 全基因片断；所得PGAM-B 基因序列与已知PGAM-B基因序列（J04173）进行比较，完全一致。⑨基因序列和蛋白读码框均正确的真核表达质粒pcDNA-PGAM 和pcDNA-HCV，分别转染HepG2 细胞后，可在细胞爬片上检测到PGAM-His 和HCV 核心蛋白的瞬时表达。 结论: ①在HepG2 细胞中，有多个细胞蛋白分子可以与HCV 核心区RNA 在体外发生特异性的结合。②HCV C-RNA 与HepG2 细胞蛋白的结合区域可能位于HCV C 区RNA 的5’端。③PGAM-B 可以与HCV C-RNA 在体外发生特异结合，提示PGAM-B 可能通过与HCV 核心区RNA 的相互作用，参与HCVRNA 的翻译和复制。④PGAM-B 和HCV 核心蛋白可以在HepG2 细胞中瞬时表达。