缓慢释放一氧化氮的染料木素前体药物的合成及其对成骨细胞作用的研究

摘要

研究背景： 骨质疏松症(OP)是一种系统性的骨骼疾病，其特征是骨量减少、骨组织显微结构退化，骨脆性增高，骨折危险性增加的一种代谢性骨病，多发生于绝经后妇女和老年男性。据流行病学统计，OP的发生率在代谢性骨病中居第二位；随着世界人口老龄化趋势的发展，OP导致的骨折并发症的发生率日益增高。 绝经后骨质疏松（PMO）在OP中占有很大的比例。较长时期以来，其治疗主要是采用激素替代疗法（HRT）。虽然HRT 在预防和治疗PMO 方面呈现出较好的效果，然而，因其副作用及禁忌症导致HRT的临床应用受到限制。据报道，由于浸润性乳腺癌和心血管疾病危险性的增加，美国国立卫生研究院提前三年结束了已经进行了5.2 年的HRT在健康绝经妇女更年期综合征的临床试验。因此，寻找安全、有效的防治PMO的药物，及缓解更年期症状，是目前研究的热点。 植物雌激素是来源于植物的一类具有类黄酮结构的物质。它们的结构与雌激素相似，能够选择性地与雌激素受体（ER）结合，呈现较弱的雌激素样作用。与雌激素相比，其副作用比较少，尤其是较少引起激素依赖性肿瘤的发生，因而得到广泛的关注。但是植物雌激素的生物活性相对较弱，疗效不稳定，难以有效改善更年期症状。目前研究较多的植物雌激素主要是大豆异黄酮类的染料木素（Gen），大豆苷元和大豆黄素等。 1994 年，Kasten TP等人研究发现，抑制一氧化氮合酶（NOS）可增加去卵巢大鼠骨质的吸收；对NOS 的抑制能够剂量依赖性地抑制成骨细胞（OB）的增殖。研究显示，去卵巢大鼠血清NO含量在骨密度和雌激素水平下降的同时亦明显降低。雌激素水平降低引起NO水平降低，NO水平降低促进骨吸收，导致骨量丢失，骨密度下降，这可能是PMO发生的重要机制之一。研究表明，PMO患者体内难以产生足够的NO以维持正常生理功能，这是NO作为替代药物治疗PMO的合理的生物学基础。研究证实，缓慢释放的小剂量NO能够促进OB增殖及其功能。因此，调控NO释放的药物具有潜在的OP治疗的广阔前景。 研究目的： 研究文献资料，根据Gen的结构特点，参考具有缓慢释放一氧化氮功能的非甾类抗炎药（NO-NSAIDs）的结构，设计、合成出将Gen与NO供体部分通过化学反应生成酯键相连的一氧化氮供体Gen（NO-G）的前体药物。该结构在体内经过生物转化，酯键断裂，游离出原药Gen和NO供体部分，后者能够缓慢释放出NO，与Gen协同发挥作用，以期对OP，尤其是PMO起到有效的预防和治疗作用。 研究方法 1. NO-G的结构设计、合成及鉴定分析 Gen的结构，参照NO-NSAIDs的结构设计，采用化学合成的方法经酯化反应和硝基化反应得到目标化合物，通过核磁（NMR），红外（IR）和质谱分析（MS）对得到的化合物进行结构确证。 2. NO-G高效液相色谱法(HPLC)检测方法的建立及其体外稳定性的实验研究。 2.1 参考文献关于Gen检测的方法，经多次实验摸索，建立了NO-G的HPLC检测方法； 2.2 NO-G的体外稳定性实验研究 2.2.1. 模拟生理环境下的稳定性实验 将NO-G溶解后分别于37℃ pH 1.0（模拟胃液环境）和pH 6.8（模拟小肠液环境）条件下震荡，于0，0.5，1，1.5，2，3h取样，行HPLC检测，考察NO-G的稳定性； 2.2.2. NO-G在培养细胞上的稳定性研究 采用成骨细胞系MC3T3-E1细胞株进行实验，HPLC检测观察NO-G在培养细胞上的稳定性。 3. NO-G体外活性研究采用成骨细胞系MC3T3-E1细胞株进行实验研究 3.1 NO-G与细胞共孵育释放NO的观察 通过Griess Reagent检测培养液中亚硝酸盐的含量间接反应NO的释放情况。以常用的NO供体SNAP为对照，比较二者NO释放的特点。 3.2 体外活性研究以Gen，SNAP和雌二醇（E2）为对照，观察新化合物对OB增殖，分化和矿化功能的影响。 3.2.1 NO-G对MC3T3-E1细胞增殖的影响a. 通过MTT法观察NO-G对细胞增殖的浓度和时间依赖关系，比较与其它药物作用的差别。 B. 流式细胞术分析NO-G对细胞周期的影响。 3.2.2 NO-G对MC3T3-E1细胞分化的影响 A. 采用ALP试剂盒检测观察NO-G对ALP活性的影响，观察其浓度和时间依赖关系；并与其它药物对ALP活性的影响进行比较。B. 采用OCN ELISA试剂盒检测NO-G对OCN分泌的影响，观察其浓度和时间依赖关系；并与其它药物对OCN分泌的影响进行比较。 3.2.3 NO-G对MC3T3-E1细胞矿化的影响 通过茜素红-S染色定量观察药物对矿化结节形成情况的影响。 实验结果： 1. 通过化学合成的方法得到产物NO-G：浅灰色粉末状，熔点125.5~127.5°C，产率约为87.6％。质谱分析其相对分子量为532.04，核磁，红外结果显示其结构与目标化合物一致。 2. 建立了NO-G的HPLC检测方法；色谱条件为：流动相，乙腈: 0.1％的冰醋酸溶液60:40；流速1ml/min；检测波长：254nm； 色谱柱，C18（250×4.6mm, 5μm, Lichrospher）；柱温：室温；进样量20μl。 3. NO-G在不同pH环境中的稳定性不同。在模拟胃液环境（pH1.0）中不稳定，37℃水浴振荡0.5h即可检测到游离的Gen，3h后NO-G基本完全分解；在模拟小肠液环境（pH6.8）下，3h内NO-G含量无明显改变。而对于体外培养的细胞，给药30min后在细胞内能够同时检测到NO-G和Gen。 4. NO-G与MC3T3-E1细胞共孵育后能够缓慢释放出NO，释放时间可持续5h左右。 5. NO-G能够促进OB的增殖，分化，并呈一定的时间、剂量依赖性；与原形药物相比，这些作用都有显著提高（P<0.05或0.01）。 6. NO-G能够促进OB的矿化。细胞培养18d，有明显的矿化结节形成；定量分析结果显示NO-G能够有效促进OB的矿化（P<0.05vs Gen, SNAP, and Gen+SNAP） 结论： 1. 本课题设计的NO-G的结构具有缓慢释放NO的特性，其合成路线简单易实现，操作过程易于控制，产物纯度较高，产率适中。通过核磁、质谱和红外等波谱分析确证其结构为设计的系列结构之一；该化合物的结构未见文献报道。 2. 实验建立的HPLC分析方法条件稳定可靠，具有可重复性。 在该色谱条件下能够同时检测出NO-G和Gen，可以实现Gen，NO-G和杂质峰的完全分离；保留时间适宜，且空白溶剂在该色谱条件下无特异吸收峰。 3. NO-G在模拟胃液环境下产生分解；但在模拟小肠液环境下具有较好的稳定性。在体外与细胞共培养，大部分药物能够通过细胞膜进入细胞内，分解释放出Gen。 4. 与SNAP相比，NO-G在培养的细胞上能够缓慢释放出小剂量的NO。这可能是NO-G作用较Gen提高的药理学基础。 5. NO-G呈时间、剂量依赖性地促进OB的增殖和分化，并能够有效促进矿化的形成，其效果均明显优于母体药物。NO-G有望成为一种新型的骨质疏松防治药物。