抗人乙酰胆碱受体单链抗体1956#的可溶性表达、纯化及其功能鉴定

摘要

重症肌无力（MG）是由乙酰胆碱受体抗体(AChRAbs)介导，补体参与的自身免疫性疾病，由于其抗原、抗体明确且免疫学发病机制也相对清楚，对研究其他自身免疫性疾病的发病机制和治疗具有指导意义。抗人AChR的单链抗体（scFv）是单价抗体并且缺乏Fc段，不会引起抗原调变作用或激活补体破坏突触后膜，可以保护NMJ突触后膜的AChR免受MG患者血清中自身抗体的攻击，成为MG治疗最有潜力的靶点。
　　以往scFv的可溶性表达多采用载体pHEN1，以带信号肽PelB的分泌型表达形式进行。尽管可以直接在胞周质或培养上清中得到可溶性scFv，然而这种方式存在可溶性蛋白产量低，纯化过程代价高的缺陷，给大量制备带来困难。本研究拟采用融合NusA标签蛋白的方式表达scFv1956＃，以期得到大量可溶性的表达产物。
　　用PCR扩增含有抗人AChRscFv1956＃的载体pHEN1中scFv1956＃的结构基因，并将其插入到原核表达载体pET44a(+)中。用重新构建的载体pET44a(+)-scFv1956＃转化菌株BL21(DE3)pLysS和Roseta-garmiB(DE3)；同时用原有载体pHEN1-scFv1956＃转化菌株HB2151和JM109，分别用两种诱导条件诱导表达：标准的1mMIPTG，37℃诱导4h；低温25℃长时间诱导20h。用SDS-PAGE来比较不同载体和菌株在不同温度和时间的诱导条件下scFv1956＃可溶性表达的量，并通过Westernblot进行鉴定。
　　结果显示PCR产物大小为785bp，与预计相符；所构建质粒经测序证实scFv1956＃核苷酸序列正确，并正确插入载体pET44a(+)。SDS-PAGE和Westernblot的结果显示，新构建的载体pET44a(+)-scFv1956＃在不同菌株和诱导条件下所得到的可溶性蛋白表达量均优于原载体pHEN1-scFv1956＃。对于载体pHEN1-scFv1956＃，换不同菌株表达或采用低温长时间的诱导方式均不能提高胞周质或培养上清中可溶性蛋白的含量；而对于载体pET44a(+)-scFv1956＃，低温长时间诱导确实有助于提高可溶性表达的量，而且用菌株BL21(DE3)pLysS表达时这种趋势更为明显。
　　用菌株BL21(DE3)pLysS表达pET44a(+)-scFv1956＃，1mMIPTG，25℃诱导20h，裂菌后的可溶性成分经Ni2+亲和层析柱纯化，并用凝血酶（Thrombin）切除融合蛋白上的NusA标签。Westernblot的结果证实酶切后相对分子量为27kD处的可溶性成分确实为带有c-MYC标签的蛋白。
　　综上所述，载体pET44a(+)表达的N端融蛋白NusA可以帮助scFv1956＃正确折叠，从而获得大量可溶性融合蛋白。低温长时间诱导确实能够提高可溶性融合蛋白的表达量。尽管融合蛋白需要进一步的纯化，酶切才能获得scFv1956＃，但是这种融合表达的策略对于大量制备scFv1956＃，以及下一步的研究和将来在分子水平治疗MG具有重要意义。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 关于重症肌无力

2 乙酰胆碱受体及其抗体

3 抗乙酰胆碱受体单链抗体及其表达策略

研究内容

1.试 验 材 料

2 试 验 方 法

结 果

4 讨 论

小 结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢