人Pcid2蛋白的可溶性表达及抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体2D7-F11和分泌该抗体的杂交瘤细胞系

摘要

本发明提供了一种表达人Pcid2可溶性重组蛋白的方法，利用可溶性Pcid2重组蛋白作为抗原免疫小鼠获得的抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体以及分泌其的杂交瘤细胞系。所述单克隆抗体与重组人Pcid2蛋白及表达人天然Pcid2蛋白的细胞呈强阳性反应，而与其它蛋白无交叉反应。本发明还提供了包括所述单克隆抗体的试剂盒和使用单克隆抗体检测内源Pcid2的含量的方法。

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白重组表达及单克隆抗体领域，更具体地，本发明涉及抗人Pcid2蛋白的可溶性重组表达，及利用可溶性表达的Pcid2蛋白为抗原制备的单克隆抗体2D7-F11，它是由小鼠杂交瘤细胞系2D7-F11产生的。 

背景技术

Pcid2(PCI domain containing 2)蛋白是真核细胞中高度保守的一种蛋白。其典型的结构特征是其序列中带有一段PCI(proteasome，COP9 signalosome，initiation factor 3)结构域。PCI结构域是在真核生物的蛋白酶体、COP9复合体及转录起始因子3复合体中广泛存在的一类功能结构域。一般位于相关蛋白的C端，约200个氨基酸，通常用来介导蛋白复合体中蛋白与蛋白间相互作用。含有PCI结构域的蛋白通常会出现在大的多蛋白复合体中，例如26S蛋白酶体、COP9信号复合体、转录起始因子3复合体。 

人Pcid2蛋白共含有399个氨基酸，其C端为PCI结构域。Pcid2蛋白在真核生物中具有高度的保守性。Pcid2的酵母同源蛋白Thp1存在于TREX-2/Sac3-Thp1-Sus1-Cdc31复合体中，该复合体与转录激活基因的核孔定位(“gene gating”)、mRNA的核孔运输密切相关。同时的报道指出，在果蝇中的Pcid2蛋白具有相同的性质，能够在细胞核与胞浆中穿梭，同mRNA的出核运输密切相关。 

最近有报道指出，Pcid2与细胞的存活、增殖密切相关。Pcid2基因敲除小鼠会发生胚胎致死。利用RNA干扰技术抑制细胞内Pcid2蛋白的表达后，细胞的增殖基本被阻断。另有研究指出，在Pcid2条 件性敲除的小鼠中，特异地敲出B细胞中的Pcid2蛋白，能够导致B细胞发育过程中的细胞凋亡，最终导致B细胞数目的下降。 

Pcid2蛋白还与干细胞的分化过程及自我更新有关。有研究者利用大规模的RNA干扰筛选策略，得到了包括Pcid2在内的148个与干细胞分化与自我更新相关的基因。进一步的实验结果确证了这一发现。以碱性磷酸酶作为细胞分化的指标，发现对Pcid2进行RNA干扰之后，碱性磷酸酶的染色水平下降，标志着干细胞发生了分化。 

最近也有报道指出，在一类比较难治疗的三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer)中，在增生的肿瘤组织中发现，Pcid2基因会发生拷贝数的异常扩增。这预示着Pcid2蛋白可能对三阴性乳腺癌的诊断和治疗提供帮助。 

Pcid2蛋白单抗的潜在用途包括：1.用于检测干细胞组织中Pcid2的含量及分布，作为干细胞分化的指征；2.检测肿瘤组织中Pcid2的含量及分布，作为肿瘤发生及发展的指标。 

发明内容

本发明的目的是提供一种表达可溶性Pcid2蛋白的方法及抗人Pcid2的单克隆抗体2D7-F11。 

在第一个方面，本发明提供了一种表达可溶性Pcid2蛋白的方法，其特征在于利用Pcid2的相互作用蛋白Dss1同Pcid2的共表达来促进Pcid2的可溶性表达，所述方法包括：

(a)分别获得Pcid2蛋白和Dss1蛋白的编码核酸序列； 

(b)将(a)中获得的Pcid2蛋白和Dss1蛋白编码核酸序列插入适合的载体中； 

(c)将(b)中构建得到的载体在适合的宿主中在适于表达的条件下进行表达。 

在一个实施方案中，所述Pcid2蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，所述Dss1蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO：2。在一个实施方案中，所述载体为原核表达载体，具体地为pETDuet-1。在一个实施方案中，所述宿主为大肠杆菌(Escherichia coli) 菌株。在一个实施方案中，所述菌株为大肠杆菌BL-21菌株。 

在第二个方面中，本发明提供一种可溶性重组人Pcid2/Dss1蛋白，其由第一方面的方法产生。在一个实施方案中，所述Pcid2蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO：1。在一个实施方案中，所述Dss1蛋白的编码核酸序列为SEQ ID NO：2。 

在第三个方面中，本发明提供一种利用本发明第二个方面所述的人重组Pcid2蛋白为抗原产生的抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体。在一个实施方案中，单克隆抗体由保藏编号为CGMCC No.5014的小鼠杂交瘤细胞系2D7-F11产生。 

在第四个方面中，本发明提供一种杂交瘤细胞系，其保藏编号为CGMCC No.5014。 

在第五个方面中，本发明提供用于检测Pcid2蛋白含量的试剂盒，其包含第二个方面所述的重组Pcid2/Dss1蛋白和/或第三个方面所述的单克隆抗体。 

在第六个方面中，本发明提供根据第三个方面所述的单克隆抗体在检测Pcid2组织分布的免疫组化方法、检测Pcid2细胞分布的免疫荧光方法以及检测Pcid2相互作用蛋白的免疫共沉淀方法中的应用。 

本发明以可溶性Pcid2蛋白为抗原，通过免疫小鼠及后续的单克隆抗体筛选制备过程，得到了针对Pcid2蛋白的单克隆抗体。进一步的抗体功能检验表明，该单克隆抗体2D7-F11既能识别重组表达的Pcid2蛋白，也能识别内源性表达的Pcid2蛋白。该单克隆抗体能够应用于ELISA、Western Blot、免疫沉淀、免疫荧光等方面。与细胞内其它蛋白不存在非特异识别。 

具体来说，本发明提供了以下内容： 

1)一种可溶性表达重组Pcid2蛋白的方法，它通过共表达Pcid2蛋白的相互作用蛋白Dss1，从而稳定Pcid2蛋白的结构，使Pcid2蛋白能够在体外可溶性存在。 

2)一种抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体2D7-F11，它由小鼠杂交瘤细胞2D7-F11(CGMCC No.5014)产生。能够用于ELISA、免疫印迹、免疫沉淀、免疫荧光及免疫组织化学等实验检测。 

3)一种产生抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体2D7-F11的杂交瘤细胞，其特征在于，它是保藏号为CGMCC No.5014的小鼠杂交瘤细胞系2D7-F11。 

4)用于检测Pcid2蛋白含量的试剂盒，其包含以上1)、2)所述的可溶性Pcid2蛋白及其单克隆抗体2D7-F11。试剂盒的制备可以通过本领域技术人员所公知的方法进行。 

5)根据以上2)的抗体或4)的试剂盒，其中所检测得到的Pcid2蛋白的含量及分布情况，可作为干细胞发育分化的标志及三阴性乳腺癌增生的表征。 

附图说明：

图1.pETDuet-1载体图谱。 

图2.Western blotting检测MCF-7细胞中的Pcid2蛋白。 

图3.免疫荧光检测MCF-7中Pcid2蛋白。 

图4.2D7-F11免疫沉淀MCF-7细胞裂解液中Pcid2蛋白(左：IgG对照，右：Pcid2 mAb)。 

图5.免疫组化检测乳腺癌组织切片中Pcid2表达。 

具体实施方式

Pcid2蛋白在干细胞能存在高表达，具有维持干细胞自我更新(self-renewal)能力的重要功能。实验表明，通过RNA干扰的方法，降低干细胞内Pcid2蛋白的水平，能够导致干细胞自我更新能力的下降，分化的出现，表现为碱性磷酸酶染色的异常。类似的报道也指出，Pcid2蛋白可能同B细胞的发育分化有关，条件性敲除小鼠B细胞表达的Pcid2蛋白可最终导致外周血中B细胞数目的下降。进一步的实验证明了在B细胞分化过程中的一些B细胞前体细胞，受Pcid2蛋白敲除的影响，出现了细胞数目的减少，这说明Pcid2在B细胞的发育分化过程中发挥着重要作用。此外，Pcid2蛋白还与细胞凋亡及细胞周期调控密切相关。同一篇报道指出，在Pcid2蛋白敲除的B细胞中，Caspase3的活性大大提高，导致大量B细胞出现凋亡特性。此外， Pcid2能够影响细胞中MAD2的表达水平，RNA实验表明，Pcid2敲除细胞中，胞浆内MAD2 mRNA的水平明显下降，最终导致MAD2蛋白表达水平的下调。MAD2是有丝分裂过程中调节细胞周期的重要蛋白，其功能保证细胞周期过程中纺锤体的正确形成。MAD2蛋白的错误下调能够导致细胞周期在有丝分裂过程中停滞，从而使Pcid2敲除细胞表现出很明显的多核特性。另外，最近又有报道指出，在三阴性乳腺癌增生过程中，Pcid2基因出现拷贝数的扩增，这表明Pcid2蛋白很可能与三阴性乳腺癌的病变过程相关，从而可能为三阴性乳腺癌的病理检测及治愈途径提供一种分子指标。关于Pcid2功能的分子机制还不是很清楚。其同源蛋白研究表明，酵母及果蝇的Pcid2同源蛋白都与mRNA的出核运输密切相关，其同源蛋白的缺失能够导致mRNA的核内聚集。另外，具有PCI结构域的其它蛋白通常能够借助PCI结构域形成大的复合体蛋白结构，存在于蛋白酶体、COP9复合体、真核转录起始因子复合体3及其它一些复合体结构中，发挥复杂的生物学功能。人的Pcid2蛋白很可能与其酵母及果蝇同源蛋白及具有PCI结构域的其它蛋白具有类似的分子机制，其复杂的功能亟需深入研究。但是，目前对于该蛋白的可溶性重组表达没有任何报道。目前已知的抗体只能在Western Blot水平识别变性的包涵体形式的重组蛋白，对于胞内内源表达的Pcid2蛋白无法检测。 

本发明包括：一种可溶性表达Pcid2重组蛋白的方法，它通过Pcid2蛋白与其相互作用蛋白Dss1共表达得到。一种特异性的抗人Pcid2蛋白的抗体2D7-F11，它由小鼠杂交瘤细胞系2D7-F11产生。该抗体在免疫学功能实验上具有广泛的应用。以重组Pcid2蛋白免疫Balb/C小鼠，应用淋巴细胞杂交瘤技术，制备了一株能够稳定分泌特异性抗人Pcid2蛋白单克隆抗体的细胞株2D7-F11。 

本发明中的一种可溶性表达Pcid2重组蛋白的方法是通过共表达Pcid2与其相互作用蛋白Dss1得到。Pcid2单独表达均以包涵体形式存在，只有与Dss1共表达才能形成正确的构象，存在于上清中。 

本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人Pcid2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株2D7-F11，该杂交瘤细胞株于2011年6月30日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.5014。 

本发明中的抗人Pcid2蛋白单克隆抗体2D7-F11的实验表明，2D7-F11与重组人Pcid2蛋白及细胞或组织内源性表达的Pcid2蛋白呈强阳性反应，但与共表达的Dss1蛋白不存在阳性反应。与细胞内其它蛋白不存在交叉反应。 

本发明中抗人Pcid2蛋白的单克隆抗体2D7-F11具有以下特点和性能：(1)ELISA实验中与重组Pcid2蛋白及细胞裂解液中的Pcid2蛋白呈强阳性反应；(2)Western Blot实验中能够识别变性的重组Pcid2蛋白及内源性表达的Pcid2蛋白的条带；(3)免疫沉淀实验能够特异性结合重组及细胞裂解液中内源性的Pcid2蛋白；(4)免疫荧光实验能够识别固定细胞中的Pcid2蛋白；(5)免疫组织化学实验能够识别固定组织切片中的Pcid2蛋白。 

实施例1 

可溶性Pcid2重组蛋白的制备和纯化 

(1)表达质粒构建 

通常以重组蛋白表达难易来看，利用大肠杆菌的原核表达策略是最简单易行的蛋白表达策略。我们成功地利用原核表达得到了可溶性的Pcid2蛋白。首先，为了表达Pcid2蛋白及其相互作用蛋白Dss1，我们利用PCR技术从cDNAs中扩增得到这两个序列(NCBI序列号NP_001120675.1、NP_006295.1)，经过限制性酶切和连接构建到Novagen的商品化原核表达载体pETDuet-1上，其中Pcid2蛋白带有His标签，用于重组蛋白的纯化，而Dss1不带任何标签。pDuet质粒能够保证两个蛋白的同时翻译表达。 

表达载体构建过程： 

Pcid2核酸序列： 

DNA Sequence Open Reading Frame：82 to 1281(SEQ ID NO：1)NM_018356.2

AGACGGACCG AGGGCCGGAA GTGACGCCAG CTGGCCCGCT TGAGGCGTAG GGGGTGGCGC TCTCCGTTCG 

GCGGCGCTCC CATGGCGCAC ATTACCATTA ACCAGTACCT GCAGCAGGTG TACGAAGCCA TCGACAGCAG 

AGATGGAGCA TCTTGTGCAG AGTTGGTGTC TTTTAAACAT CCTCATGTTG CAAACCCACG ACTTCAAATG 

GCCTCTCCAG AGGAGAAGTG TCAACAAGTC TTGGAACCCC CTTATGATGA AATGTTTGCA GCTCATTTAA 

GGTGCACTTA TGCAGTGGGG AATCATGACT TCATAGAGGC ATACAAGTGC CAGACCGTGA TAGTCCAATC 

ATTCTTGCGA GCATTGCAGG CCCACAAAGA AGAAAACTGG GCTCTGCCTG TCATGTATGC AGTAGCGCTT 

GACCTTCGAG TGTTTGCCAA TAATGCAGAT CAACAGTTGG TAAAGAAAGG AAAAAGCAAA GTTGGGGACA 

TGTTGGAAAA AGCAGCAGAG TTACTGATGA GCTGTTTCCG GGTCTGTGCC AGCGACACCC GTGCTGGTAT 

AGAGGACTCT AAGAAGTGGG GCATGCTGTT TCTGGTGAAC CAGCTGTTTA AAATCTACTT CAAGATCAAC 

AAACTCCATT TATGTAAACC CCTAATTAGA GCAATTGACA GCTCAAACCT GAAAGACGAT TACAGCACTG 

CACAGAGAGT AACATACAAA TACTACGTTG GACGCAAGGC TATGTTTGAC AGCGATTTTA AGCAAGCTGA 

GGAGTACCTG TCATTTGCCT TTGAGCATTG TCACCGTTCT AGTCAGAAGA ACAAAAGGAT GATTCTGATC 

TATTTGCTTC CAGTAAAAAT GCTATTGGGT CACATGCCCA CTGTGGAGCT CCTGAAAAAG TATCACCTGA 

TGCAGTTTGC GGAAGTAACC AGAGCTGTGA GCGAGGGCAA CCTGCTGCTG CTGCACGAGG CGCTGGCGAA 

GCACGAGGCC TTCTTCATTC GCTGCGGAAT CTTCCTCATC CTGGAGAAGC TGAAGATCAT CACCTACAGG 

AACCTCTTTA AGAAAGTGTA TTTGTTACTG AAAACACACC AGCTGTCTCT GGATGCTTTT CTGGTTGCCT 

TGAAGTTCAT GCAGGTGGAG GACGTGGACA TTGACGAAGT TCAGTGTATT CTGGCTAACT TGATATACAT 

GGGACACGTC AAAGGCTACA TATCGCATCA GCATCAGAAG CTGGTGGTCA GCAAGCAGAA CCCATTTCCT 

CCCCTGTCCA CGGTGTGTTG AAAGTACACG GAGCCCCGAG GACGGACTCG GCTGGTTCTG GAGTCTTTGT 

GAGACTTCTT TGAAGGAGGC TTTGCGTGAA GGCTGCTCGG CTCACTTTTC CTAAGTGTGG TTCCTGAAGG 

CTGTCTTTGT AACTTTTTGT AGTTCTTTGT GTAAAAAGCG TATTCTGAAT TTATACACAT GGCATGTTCT

TCATTATATC TTCCAGGATA CATCTATTTT TATATATTAA ATTTGAATGT GTTATCAAAA TGCTTGGTTA 

ACTTAAGGCA CCTTTTTAAA AGCAGAATTT AATTTGATTT AAATTTTCCA GATTTTATAG CTTGCCTGTA 

TGGATGCTCC TCAATTTATG ATAGGGTTAC ATCCCAATAA ACTTATTTTA TTTGCCTTTG CAAAAAAAAA 

AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 

Dss1核酸序列： 

DNA Sequence Open Reading Frame：129 to 341(SEQ ID NO：2)NM_006304.1

ATTCTTTCCC CAAGTCTCTA TGGTAGCGTC AGCGTCGGAG GCGGTAGTGA CGGTGGCGTT TCCTTGAGGA 

AGAGTGAGGG TTCCAACTTT TCTGCTTATC TGGGAGGTGT TGGGCGCGGA CAGTCGAGAT GTCAGAGAAA 

AAGCAGCCGG TAGACTTAGG TCTGTTAGAG GAAGACGACG AGTTTGAAGA GTTCCCTGCC GAAGACTGGG 

CTGGCTTAGA TGAAGATGAA GATGCACATG TCTGGGAGGA TAATTGGGAT GATGACAATG TAGAGGATGA 

CTTCTCTAAT CAGTTACGAG CTGAACTAGA GAAACATGGT TATAAGATGG AGACTTGATA GCATCCAGAA 

GAAGTGTTGA AGTAACCTAA ACTTGACCTG CTTAATACAT TCTAGGGCAG AGAACCCAGG ATGGGACACT 

AAAAAAATGT GTTTATTTCA TTATCTGCTT GGATTTATTT GTGTTTTTGT AACACAAAAA ATAAATGTTT 

TGATATAAAA AAAAAAAAA 

利用PCR将Pcid2(SEQ ID NO：1)、Dss1(SEQ ID NO：2)扩增出来并在序列两端加入双酶切位点(Pcid2两端酶切位点为EcoRI、HindIII；Dss1两端酶切位点为NdeI、XhoI)，将上述两段序列分别插入pETDuet-1载体(pETDuet-1载体图谱见图1)的MCS1、MCS2位置。 

(2)Pcid2蛋白表达 

将步骤(1)中构建好的pETDuet-1质粒转入表达菌株中，我们选用了通常的BL21菌株即得到了Pcid2蛋白的高效的可溶表达。其表达流程同普通的原核蛋白表达流程。简要过程为表达质粒转化BL21蛋白表达菌株，12小时后挑克隆至10ml Amp抗性LB液体培养基中，摇菌12小时左右至OD₆₀₀≈4，按1∶100接入1L Amp抗性液体培养基中培养至OD₆₀₀≈1，加入1mM IPTG诱导4小时，4000rpm离心0.5小时收菌，超声破碎，16000rpm离心0.5小时取上清，过镊柱纯化，用含300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，即得到带有His标签的重组蛋白，His标签能够通过蛋白酶切除，并经过后续的纯化，得到的产物序列与人Pcid2蛋白完全一致。蛋白电泳证明，虽然我们纯化过程中是针对Pcid2蛋白上存在的His标签，但是，Dss1蛋白同样随Pcid2而纯化出来，表明二者之间通过相互作用结合在一起。我们的实验也表明，仅表达Pcid2蛋白会导致该蛋白完全存在于包涵体中，而无可溶形式存在。在后面的抗体制备过程中，以包涵体蛋白为抗原制备的抗体，虽然可能在Western Blot水平，识别变性的Pcid2蛋白，但在免疫沉淀、免疫荧光、免疫组化等实验中，很难识别具有类似天然构像的Pcid2蛋白。我们的表达方法通过Pcid2与其相互作用蛋白Dss1的相互作用从而稳定了Pcid2的结构，使其在表达过程中能够形 成正确的构像，从而能以可溶形式存在。Dss1仅含有70个氨基酸，是分子量很小的小分子肽段，常常能够与具有PCI结构域的蛋白共同存在，也被有些研究人员称为“分子胶”，能够把某些蛋白结构中不稳定的区域，通过与Dss1的相互作用，填补不稳定区域，从而使蛋白形成正确构像。我们的实验表明，在原核水平和真核水平上，Dss1都能够促进Pcid2蛋白稳定性的提高。 

实施例2 

(1)杂交瘤的制备 

以实施例1中所得的重组人Pcid2/Dss1蛋白作为抗原免疫Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹腔注射，每只小鼠每次注射50微克重组人Pcid2/Dss1蛋白。2周后对小鼠进行再次免疫，注射量和方法不变。待小鼠血清效价达到要求，即效价达到1∶200以上，之后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行冲击免疫。 

在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCC CRL-1772)。 

将从免疫小鼠脾脏中分离得到的致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0(ATCC CRL-1772)融合(《实用免疫学》，杨廷彬主编，长春出版社，1994年12月出版)，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞，用HAT培养基(购于Invitrogen公司，HAT系次黄嘌呤(hypoxantin)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(thymidin)三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基)常规细胞培养操作进行选择性培养。 

接着，用ELISA方法检测上述杂交瘤细胞培养上清：以重组人Pcid2蛋白包被96孔板，4℃过夜。用含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加待检上清100μl，37℃孵育1h。用含0.05％tween-20的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加酶标二抗(抗小鼠IgG-HRP)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司)，37℃孵育1h。洗涤3次，加底物显色剂四甲基联苯胺(TMB)(购自北京中杉金桥生物技术有限公司) 50μl，室温静置5分钟，加终止液(2mol/L的硫酸)50μl。结果用BIORAD 680型酶标仪测定，检测波长为450nm值，OD值高于阴性对照2倍以上者可视为阳性。 

然后，将选出的阳性杂交瘤细胞克隆化培养(有限稀释法，以小鼠腹腔巨噬细胞为饲养细胞)。经过2-3轮克隆化培养，获得稳定的能够产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞克隆扩大培养，并冻存保种。 

本发明中的一种阳性杂交瘤细胞为抗人Pcid2蛋白杂交瘤细胞株2D7-F11，将该杂交瘤细胞株与2011年6月30日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC，中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏号为CGMCC No.5014 

(2)2D7-F11单抗的制备和纯化 

将上述杂交瘤细胞2D7-F11接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，再从腹水中提取单抗。单抗2D7-F11的纯化：采用Protein G亲和层析法。首先制备Protein G亲和层析柱(购于“GE”公司)，用PBS(磷酸盐缓冲液)平衡柱子后，取含2D7-F11单抗的腹水过柱，然后用PBS洗柱子，至OD值接近于零，以0.2M的甘氨酸-HCl溶液(pH2.8)洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，洗脱液经透析浓缩后-20℃冻存。 

实施例3 

2D7-F11单抗的鉴定 

将在实施例2中制备的2D7-F11单抗，按常规方法对重组人Pcid2蛋白及人肿瘤细胞系细胞裂解液进行western blotting。如图2所显示，2D7-F11单抗与重组人Pcid2蛋白及表达人天然Pcid2蛋白的细胞呈强阳性反应，而与其它蛋白包括Dss1无交叉反应。 

将在实施例2中制备的2D7-F11单抗，按常规方法对肿瘤细胞系HeLa、MCF-7、HepG2(购自协和细胞库)等进行免疫荧光反应。结 果表明，2D7-F11单抗与表达人天然Pcid2的细胞呈强阳性反应，如图3所显示。 

在实施例2中制备的2D7-F11单抗，与MCF-7细胞的裂解液进行免疫沉淀反应，能够特异识别细胞裂解液中的Pcid2蛋白，而与其它蛋白没有交叉反应，如图4所显示。 

在实施例2中制备的2D7-F11单抗，按常规方法检测乳腺癌组织的石蜡切片，可以观察到特异的Pcid2组织分布，如图5所显示。