慢病毒载体介导的RNA干扰抑制肝星状细胞结缔组织生长因子表达及其抗肝纤维化作用

摘要

病毒、酒精、肝毒性药物等因素所致的慢性肝损害，均会产生肝纤维化，进而发展为肝硬化，目前尚无有效的根治办法。我国罹患慢性肝损害的人数众多，寻找有效的抗肝纤维化方法，阻止肝硬化的进展，是亟待解决的问题。
　　结缔组织生长因子（CTGF）作为促肝纤维化的主要细胞因子，在肝纤维化的机制中发挥重要作用。CTGF主要通过介导转化生长因子－β（TGF-β）活化肝星状细胞（HSC），导致细胞外基质（ECM）过度积聚，从而导致肝纤维化。HSC活化是肝纤维化发生、发展的中心环节，CTGF在HSC中的高表达是HSC活化不可或缺的条件，因此，抑制CTGF在HSC中的表达，就有可能阻止HSC的激活，进而阻止肝纤维化的进程。
　　RNA干扰（RNA interference，RNAi）是生物体内一种序列特异性转录后基因沉默（PTGS），慢病毒载体是常用的介导RNAi的病毒载体之一，既可感染分裂期细胞又可以感染非分裂期细胞，不易诱发宿主免疫反应，能高效地感染靶细胞，表达的持续时间较长，是基因沉默的有效工具。
　　本研究选择HSC为靶细胞，以CTGF为切入点，应用慢病毒载体介导的RNAi技术，沉默CTGF基因功能，探讨其在HSC活化中的作用，为肝纤维化的防治及其发病机制研究提供有益的支持。
　　1、包含目的基因的RNAi慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定
　　根据GenBank收录的大鼠CTGF(NM_022266)基因序列设计了4条siRNA及1条阴性对照序列，退火形成双链DNA，双酶切后定向克隆到慢病毒载体转移质粒pGCL-GFP中，克隆转化后提取质粒，PCR鉴定及DNA序列测定证实所插入的片段序列与合成序列完全一致，表明已成功构建了5个包含目的基因（1个为阴性对照基因）的慢病毒载体转移质粒。
　　2、RNAi慢病毒载体的包装及筛选
　　将构建成功的转移质粒与两种辅助包装元件载体质粒共转染293T细胞，包装成4个表达CTGFsiRNA及1个阴性对照siRNA的慢病毒载体。继而将5个重组体分别感染HSC-T6，应用RT-PCR和WesternBlot筛选出1个抑制效率最高的重组体，命名为Len／siRNA-CTGF，作为随后实验应用的工具载体，其瞬时感染的抑制效率达84.6％。
　　3、慢病毒载体介导的CTGF基因沉默效应及其对下游基因表达的影响
　　HSC-T6作为活化的肝星状细胞系，以高水平表达I型胶原（COLI）、金属蛋白酶组织抑制因子－1(TIMP-1)和TIMP-2为特点。通过了解HSC-T6在CTGF基因沉默前后COLI、TIMP-1和TIMP-2的mRNA的变化，来分析CTGF对HSC活化的影响。
　　将Len／siRNA-CTGF及阴性对照病毒分别感染HSC－T6细胞，96h后采用RT-PCR的方法验证Len／siRNA-CTGF对HSC-T6中CTGF的抑制效果，并检测Len／siRNA-CTGF对TIMP-1、TIMP-2及COLI等表达的影响。结果发现Len／siRNA-CTGF可以显著抑制肝星状细胞系HSC-T6细胞中CTGF基因的表达，抑制效率达到70％左右；且CTGF被抑制的同时，TIMP-1、TIMP-2及COLI的表达量分别下降到阴性对照组的23％、18％和50％。
　　4、CTGF基因沉默与HSC增殖、活化的关系
　　碘化丙啶（PI）染色流式细胞仪DNA含量分析法（PI/FCM）分析HSC-T6DNA含量、MTT法观察细胞生长曲线，发现在CTGF基因沉默后HSC-T6的增殖及生长均受到抑制。
　　结论：
　　成功构建并筛选出了介导CTGF基因沉默的慢病毒载体，证实慢病毒载体介导的RNAi在沉默CTGF基因后抑制HSC-T6中TIMP-1、TIMP-2及COLI等基因的表达，而HSC-T6的增殖和生长也受到了抑制，因此可能有助于抗肝纤维化的发生。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor ,CTGF）

二、RNAi

三、慢病毒载体

正文

实验一 包含目的基因的 RNAi 慢病毒载体转移质粒的构建及鉴定

1. 材料

2．方法

3．结果

4．讨论

实验二 RNAi 慢病毒载体的包装及筛选

1．材 料

2．方法

3．结果

4．讨论

实验三 慢病毒载体介导的 CTGF 基因沉默效应及其对下游基因表达的影响

1．材料

2 方法

3．结果

4．讨论

实验四 CTGF 基因沉默与 HSC 增殖、活化的关系

1．材料

2．方法

3．结果

4．讨论

小结

参考文献

个人简历及发表论文

致谢