GLT-1基因siRNA真核表达载体的构建及其在大鼠神经胶质细胞中的抑制效应

摘要

谷氨酸(glutamate,Glu)是细胞外最主要兴奋性神经递质,使兴奋性氨基酸维持在相对较低的水平,可确保适当的信号-噪声比率和防止谷氨酸受体过度激活而导致细胞死亡。谷氨酸转运体(glutamate transporters,Glu Ts)是一种糖蛋白,位于神经胶质及神经元细胞膜上的,它的主要功能是迅速转运突触间隙中的Glu,保护神经元不受Glu毒性影响和维持突触间信号的正常传递。癫痫发作的致病原因很多,主要包括遗传性、发育及后天获得三类。在啮齿类动物模型中,通过基因的敲除或抑制改变了谷氨酸受体或Glu Ts的表达,能够诱发或抑制癫痫发作。GLT-1是Glu Ts的5种亚型之一,它是脑内最主要的转运体蛋白,表达在星形胶质细胞上。研究发现,癫痫发作及其易感性的形成与GLT-1的表达变化有关。双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种简便而快速的抑制生物体内基因表达的方法。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)激活核糖核酸酶对同源序列mRNA的进行特异性降解,从而导致基因沉寂的现象,而产生的表型是相同无效突变体或相似的突变等位基因。特殊形式的基因沉寂还包括植物中的共抑制和真菌中的抑制现象,它还与转座子沉寂,抗病毒防御机制,基因调控和染色体变异有关。大量的分子生化研究表明RNAi诱导的基因沉寂分为两步,首先,导入细胞的dsRNA被Dicer酶(RNA酶Ⅲ家族成员)消化成21-23个核苷酸的siRNA;然后,其与核糖核酸酶等形成RNA诱导沉寂复合体(RNA induced silencing complex,RISC),对它的同源基因进行酶解。而Dicer酶、RNA依赖的RNA聚合酶、解旋酶和双链RNA内切核酸酶在不同的生物体的RNAi中起着重要作用,其中部分还调控许多非编码RNA的生物作用,称为微小RNA(micro-RNA)。微小RNA和RNAi很大程度上在生物合成和功能上相似。最近RNAi方面的研究集中在基因组DNA的甲基化,异染色质形式改建和程序DNA的消除。而从其变化来看,基因功能的沉寂效果是严格的。由于RNAi的特异性和高效率,它不仅是功能基因组学的重要工具,而且有助于相关基因疾病的诊治。
　　目的:利用RNAi技术,以GLT-1为靶基因,设计构建siRNA真核表达载体,进行测序鉴定,并检测该表达载体转染神经胶质细胞后GLT-1基因表达情况和对细胞生物学行为的影响,为进一步研究癫痫的发病机制提供新的技术方案和理论依据。
　　方法:根据GLT-1基因的序列特点和siRNA的设计原则,设计其shRNA的核苷酸片段。退火后将其克隆入pSupressorNeo,构建可表达大鼠GLT-1基因siRNA的重组真核表达质粒pSuppressorNeo-GLT-1。利用脂质体法将其转染神经胶质细胞后,采用RT-PCR,Western-blot及免疫荧光法等方法检测转染后的神经胶质细胞中GLT-1基因的转录和蛋白表达水平。
　　结果:1.所构建载体pSuppressorNeo-GLT-1(Pa,Pb,Pc)经限制性酶切鉴定和基因测序证实为GLT-1 siRNA的真核表达载体;2.利用成功构建的三种siRNA表达质粒,通过脂质体介导,瞬时转染神经胶质细胞,分别采用RT-PCR、Western-blot和免疫荧光法检测GLT-1的mRNA及蛋白水平,GLT-1 siRNA真核表达载体高效而特异地沉默了神经胶质细胞中GLT-1基因的表达,但针对不同部位序列的siRNA真核表达载体抑制效率不同,以pSuppressorNeo-GLT-1(Pa,Pb)的抑制效果较佳。
　　结论:本实验在国内首次利用RNAi技术,以GLT-1基因为靶点,成功构建pSuppressorNeo-GLT-1质粒载体;瞬时转染原代培养的大鼠神经胶质细胞后可以明显抑制GLT-1基因的表达。以RNAi技术为平台,探讨GLT-1基因与癫痫的相关性,可以为癫痫的发病机制的研究供一种新的思路与方法。

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

实验研究

第一部分 GLT-1 基因siRNA 真核表达载体的构建及鉴定

0 引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 GLT-1 基因siRNA 真核表达载体在大鼠神经胶质细胞中抑制效应的检测

0 引言

1 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢