重组hTAZ慢病毒表达载体的构建及其对前成骨细胞MC3T3-E1分化的影响

摘要

目的：构建人真核表达的hTAZ慢病毒载体pLenti6/V5-hTAZ，转染293FT细胞获得重组慢病毒颗粒，研究hTAZ对前成骨细胞MC3T3-E1分化的调控作用。
　　方法：将已经过测序验证的，含有hTAZ基因慢病毒入门质粒pENTR221-hTAZ通过LR反应克隆到慢病毒载体pLenti6/V5-DEST中。对重组质粒进行酶切鉴定并在细胞中验证表达。将该重组载体和慢病毒包装质粒充分混合，用阳离子脂质体Lipofactamine转染293FT细胞，培养和待细胞完全裂解后收集富含hTAZ基因的慢病毒颗粒上清液，取适量上清液感染MC3T3-E1细胞，采用杀稻瘟菌素（Blastcidin）筛选，建立了稳定过量表达hTAZ蛋白的MC3T3-E1/hTAZ细胞系。用条件培养基诱导MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ细胞成骨、成脂分化，vonKossa和茜素红染色比较MC3T3-E1和MC3T3-E1/hTAZ成骨分化程度差异；油红O染色比较其成脂分化差异，考察hTAZ基因过表达对前成骨细胞分化的影响。
　　结果：凝胶电泳和测序结果均证明hTAZ重组慢病毒载体pLenti6/V5-hTAZ构建正确，并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒，并成功感染MC3T3-E1细胞。vonKossa染色和茜素红染色结果表明，MC3T3-E1/hTAZ细胞成骨分化强于未转染细胞，而其成脂分化受抑制。
　　结论：本研究构建了人真核表达的质粒载体pLenti6/V5-hTAZ，并能在细胞中正确表达。成功包装了hTAZ病毒并获得过表达hTAZ的MC3T3－E1细胞。过表达hTAZ可促进MC3T3-E1向成骨细胞分化，抑制其成脂分化。

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文献回顾

（1）现行骨质疏松症的研究与治疗多着眼于成骨细胞成骨作用和破骨细胞破骨作用的失衡。

（2）骨质疏松症患者的骨髓中还存在着成脂和成骨分化的失衡。

（3）TAZ，是 MSCs 分化中的调节器分子，可能成为骨质疏松症治疗的新靶点。

（4）骨质疏松症基因治疗的途径和载体选择

正文

重组 hTAZ 慢病毒表达载体的构建及其对前成骨细胞MC3T3-E1 分化的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢