B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠HBsAg免疫效果影响的初步研究

摘要

全球目前约有3.6亿慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染者,其中约有10％左右发展为肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV所致疾病人数在50万到120万。免疫系统在HBV慢性感染的病程和转归中起着至关重要的作用，慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)患者体内免疫功能异常,抗HBV特异性细胞免疫功能低下，主要表现为抗病毒相关的细胞因子分泌低下及病毒在体内的持续存在。近期研究表明，程序性死亡蛋白-1（programmeddeath-1,PD-1）及其配体（B7-H1，即PD-L1）与感染的慢性化有关，阻断PD-1与其配体B7-H1（PD-L1）的结合，可增强T细胞的抗病毒作用。本研究拟通过体内阻断PD-1/PD-L1途径，改善HBsAg免疫刺激HBV转基因小鼠抗HBV免疫功能，为治疗慢性乙型肝炎探寻新方法。
　　目的：
　　应用HBV转基因小鼠动物模型，观察B7-H1蛋白疫苗免疫后对PD-1/PD-L1的阻断效果及其是否能够增强对HBsAg的免疫应答。
　　方法：
　　①15只HBVTg雌性小鼠随机分为HBsAg组、重组人B7-H1联合HBsAg组、生理盐水对照组。②HBsAg组每只小鼠腹腔注射HBsAg200μL(含HBsAg10μg)；B7-H1联合HBsAg组腹腔注射HBsAg（含HBsAg10μg）及重组人B7-H1（含B7-H140μg），终体积为200μl；生理盐水对照组腹腔注射200μL生理盐水；各组小鼠每两周免疫/注射1次，共4次，末次免疫后2周处死小鼠取脾。③3组小鼠均在免疫前1天及免疫后2、4、6、8周经眶后静脉丛穿刺采血,每次采血0.3～0.5mL，高速离心（13000r/min,10min）后收集上清置-20℃冰箱保存备用。④记录3组小鼠免疫前体重、HBsAg定量，比较各组之间有无差异。⑤应用ELISA方法检测B7-H1蛋白疫苗免疫后2、4、6、8周血清抗体滴度。⑥应用HBsAbELISA试剂盒检测各试验组产生抗乙肝病毒表面抗原抗体（抗-HBs）的水平。⑦按常规制备脾细胞悬液，应用HBsAg刺激后观察各组脾细胞产生IL-2和IFN-γ的量。⑧应用ELISPOT试剂盒检测各实验组小鼠分泌HBsAg特异性IFN-γT细胞的数量。⑨用MTT法检测各组淋巴细胞增殖功能。⑩在统计学软件SPSS中分析数据，数据均以?x±s表示，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　①3组Tg小鼠的平均体重分别为27.2±0.96g、26.6±0.55g、27.1±0.752g；3组小鼠免疫前血清HBsAg滴度分别为5307.9±437.8IU/mL、5335.4±523.5IU/mL和5554.8±439.5IU/mL；3组小鼠无论是体重还是免疫前HBsAg滴度均未见明显差异。②B7-H1蛋白疫苗免疫小鼠后，血清抗体滴度随免疫次数的增加而升高，并可维持较高的滴度。③免疫治疗6周、8周，HBsAg组及HBsAg+B7-H1组均100％出现表面抗原抗体，对照组始终为阴性，但HBsAg组及HBsAg+B7-H1组两组之间抗体滴度无明显差异（P>0.05）。④HBsAg组及HBsAg+B7-H1组所诱生的Th1类细胞因子（IL-2、IFN-γ）的水平与生理盐水对照组相比明显增高(P<0.05）,IL-2分别为306.7±94.8pg/ml、327.9±109.6pg/ml、124.5±55.7pg/ml，IFN-γ分别为569.0±132.1pg/ml、647.8±161.8pg/ml、99.2±50.2pg/ml，但HBsAg组及HBsAg+B7-H1组之间无显著性差异（P>0.05）。⑤HBsAg单独免疫及HBsAg+B7-H1联合免疫组小鼠脾细胞HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量较生理盐水对照组增加近1倍（P<0.05），分别为57.8±5.4、52.4±4.5、23.6±3.6,但HBsAg与HBsAg+B7-H1两组间无明显差异（P>0.05）。⑥淋巴细胞特异性增殖试验中，HBsAg组及HBsAg+B7-H1组刺激指数（SI）明显高于生理盐水对照组，分别为2.29±0.30、2.30±0.36和1.33±0.26，且差异有统计学意义（P<0.05），而HBsAg组与HBsAg+B7-H1组之间无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1、HBsAg可以诱导乙肝转基因小鼠产生特异性的体液免疫，并可诱导产生高水平Th1类细胞因子（IL-2、IFN-γ），打破免疫耐受。
　　2、应用B7-H1蛋白疫苗阻断PD-1/PD-L1对HBsAg在HBV转基因小鼠中的免疫效果无明显影响，但仍需重复试验加以证实。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、乙肝病毒感染的免疫学研究现状

二、PD 分子的结构与功能

三、乙型肝炎病毒动物模型研究进展

正文

B7-H1 蛋白疫苗对 HBV 转基因小鼠 HBsAg免疫效果影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢