乙型肝炎疫苗联合B7-H1蛋白疫苗对HBV转基因小鼠抗HBsAg免疫应答的影响

摘要

据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染过乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV），其中3.5亿人为慢性HBV感染者。乙型肝炎及其导致的失代偿性肝硬化、重型肝炎和肝细胞癌等终末期肝病不仅危害全人类的健康，而且也是当前危害中国人民生命健康的严重的公共卫生问题。虽然经过各国科学家的长期努力，已初步阐明HBV的持续复制和机体抗HBV免疫反应的低下是乙型肝炎慢性化的基本原因，并且研发了若干有一定疗效的治疗药物和方法，但是距离治愈和彻底战胜乙肝肝炎仍有相当长的路要走，进一步深入研究和探索各种治疗慢性乙型肝炎的新药物和新方法，仍然是中国和全球科学家及医务工作者面临的严峻挑战和当务之急。
　　程序性死亡因子1及其配体1（programmed death1,PD-1;programmed death1 ligant1,PD-L1）是近年发现的重要的免疫调节分子，也是当前乙型肝炎免疫发病机制研究的热点。PD-1属于免疫球蛋白超家族成员，是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白，以单体形式存在，可介导负性调节信号且在T、B淋巴细胞中都有表达。PD-L1又称B7-H1（B7 homolog1）是Dong等人发现的第三个B7家族的成员，也属于Ⅰ型跨膜蛋白，在肝脏的抗原提呈细胞和星形细胞上均有表达。
　　PD-1/B7-H1信号通路能够负性调节T、B细胞参与的免疫反应，参与免疫耐受，使病毒特异性T细胞的免疫功能受到抑制，通常在病毒感染发生时PD-1及B7-H1的表达上调。PD-1/B7-H1信号通路是HBV逃避免疫监视、引发慢性HBV感染的重要通路，可能成为慢性HBV感染的有效治疗靶位。有报道HBV转基因小鼠（Tg鼠）处于对HBV的免疫耐受状态，对各种HBV抗原和HBV感染均不产生细胞和体液免疫应答，以上特点与某些慢性HBV感染者类似。因此，本课题引进HBV-Tg小鼠模型，应用第四军医大学药学系生物制药学教研室制备的重组人B7-H1蛋白疫苗，拟通过主动免疫诱生HBV转基因小鼠产生抗B7-H1的抗体，以阻断PD-1/B7-H1信号通路和上调抗HBV免疫应答、加速HBV的清除、减缓和阻止乙型肝炎慢性化，为探索慢性乙型肝炎的治疗新方法提供理论依据。
　　本课题主要研究内容和结果如下：
　　1、用不同剂量的乙型肝炎疫苗和B7-H1蛋白疫苗分别于0周、2周、4周、8周共4次联合免疫HBV转基因小鼠，于1周、3周、5周、7周、9周、11周、13周眶后取血7次，分离血清冻存于-20℃。应用ELISA法检测转基因小鼠在不同时间点血清抗B7-H1抗体滴度。结果发现5周起血清中即能测到 B7-H1抗体，且同一时间点各组之间的抗体滴度值并无明显差异。
　　2、在免疫后第14周末处死小鼠取脾细胞，检测不同的免疫方法对HBsAg特异性分泌IFN-γT细胞数量、对小鼠脾细胞产生HBsAg特异性Th1类细胞因子（IFN-γ及IL-2）及对小鼠淋巴细胞增殖的影响。显示乙肝疫苗联合 B7-H1蛋白免疫各组与相同剂量 HBsAg蛋白单独免疫组相比，分泌IFN-γ的HBsAg特异性T细胞数量下降，IL-2均明显减低（P＜0.05），但 IFN-γ无明显差异，脾淋巴细胞分泌 IFN-γ的水平各组间无明显差异；MTT法测定的淋巴细胞增殖能力各组间也无明显变化。
　　上述研究结果表明，B7-H1蛋白疫苗虽然可以诱导HBV转基因小鼠产生明显的抗B7-H1抗体应答，但不能增强抗HBsAg的免疫应答。较小剂量的HBsAg即可引起HBV转基因小鼠TH1类细胞因子（IFN-γ及IL-2）的分泌以及淋巴细胞增殖。
　　本研究结果也提示，单纯通过 B7-H1蛋白疫苗免疫的干预策略，并不能明显增强HBV转基因小鼠的抗HBV免疫反应，多靶点、多途径的联合干预可能有助于打破HBV感染后的免疫耐受和免疫低应答状态，并最终实现慢性乙型肝炎的彻底治愈。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 HBV 的流行现状

2 HBV 病原学

3 HBV 慢性感染的治疗现状

4 PD-1/B7-H1 信号通路的概况

5 PD-1/B7-H1 信号通路与疾病的相关意义

6 重组人 B7-H1 蛋白概况

7 乙型肝炎病毒感染动物模型的建立

正文

乙型肝炎疫苗联合 B7-H1 蛋白疫苗对 HBV 转基因小鼠抗 HBsAg 免疫应答的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢