脂蟾毒配基诱导肝癌HepG2细胞凋亡的相关机制研究

摘要

1、研究目的
　　脂蟾毒配基（Resibufogenin，RBG）为强心甾体化合物，化学名称为（3β,5β,15β）-14,15-环氧-3-羟基-5-酜酸丁二酯-20,22-二烯醇化合物，化学分子式C24H32O4，分子量384.5，白色棱柱状晶体。由中华大蟾蜍或黑框蟾蜍耳后腺的干燥分泌物即蟾酥中分离得到的脂溶性成分蟾毒配基类化合物。文献报道RBG具有镇痛、消炎、麻醉、抗癌、抗辐射、强心等多种药理活性。目前，药理活性研究多集中在治疗先兆子痫、高血压及少量抗肿瘤等方面。国外文献报道多集中在对心脏的作用方面，但RBG对HepG2肝癌细胞增殖、凋亡、细胞周期等作用的研究尚未见报道。本课题采用肿瘤细胞培养和建立肝癌移植瘤动物模型等方法，探讨和揭示RBG对人肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用及其机制研究，为RBG的新药开发提供实验依据。
　　2、方法
　　2.1RBG对多种细胞的MTT及抑制肝癌HepG2细胞增殖研究以抑制增殖为指标，筛选SD大鼠乳鼠心肌细胞、HepG2、SMMC-7721、SW620、Eca-109、LOVO等6株细胞为靶细胞，筛选对药物敏感的细胞株作为本课题的研究对象，以确定RBG的最佳作用浓度和作用时间。采用相差显微镜、Hoechst33258染色、透射电镜等方法，观察不同浓度RBG作用不同时间后细胞的形态学改变。PI单染色检测细胞周期的变化；流式细胞术（Annexin-V-FITC和PI双标记）检测细胞凋亡率。
　　2.2RBG对HepG2细胞的作用机制研究罗丹明123荧光染色测定线粒体跨膜电位变化；Westernblot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-c、Bcl-2、Bax、Caspase-8，9，3的表达；通过westernblotting法检测细胞周期相关蛋白p21、p53、PCNA和cyclinB1的表达。
　　2.3RBG对裸小鼠HepG2肝癌细胞移植瘤的作用及其机制研究以荷瘤鼠为动物模型，观察RBG对裸鼠HepG2肝癌细胞移植瘤的作用。采用1×107个/mLHepG2细胞接种于BALB/Cnu/nu裸小鼠肢体皮下，建立移植瘤肝癌动物模型；10、5和1mg/kgRBG灌胃给药14d，停药5d后观察动物的体质量变化，动物处死后，取瘤体及主要脏器，称瘤体重量并计算抑瘤率；心、肝、脾、肺、肾等重要脏器进行病理切片、H.E.染色；取各组部分肿瘤组织进行免疫组化实验，观察细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达；另取各组肿瘤组织，以蛋白印迹法（Westernblot）检测其细胞凋亡相关蛋白Cyt-c、Bcl-2、Bax、Caspase-8，9，3的表达。以此综合评价RBG对肝癌的治疗效果，并探讨其可能的作用机制。
　　3、结果
　　3.1RBG对细胞的作用研究表明，在SD大鼠乳鼠心肌细胞、HepG2、SMMC-7721、SW620、Eca-109、LOVO等6种细胞中，RBG对HepG2细胞的作用最强，对其抑制增殖作用表现出时间和浓度依赖性。RBG作用HepG2细胞48h后，可诱导细胞形态和周期发生明显改变；显微镜观察到，2μmol/L和4μmol/LRBG组及阳性对照组细胞形态发生明显变化，细胞密度明显降低，大部分细胞体积缩小，亮度减弱，边缘不清，细胞数量明显减少，甚至出现溶解性死亡。透射电镜观察到细胞凋亡增多，核缩小，染色质致密，呈颗粒状分布在核膜内侧，呈新月状，后期凋亡细胞发生坏死；Hoechst33258染色观察到，在正常组细胞中，细胞核规则，细胞内荧光弥散均匀；药物处理组中，胞核内出现颗粒状荧光，核固缩、染色质凝聚并碎裂。FCM结果显示，RBG可诱导HepG2细胞凋亡。相同时间（48h）不同浓度和相同浓度（2μmol/L）不同时间的细胞周期检测显示：在药物作用48h和2μmol/LRBG组作用后，细胞G2/M期比例升高，G0/G1期细胞比例明显降低。
　　3.2RBG抑制HepG2细胞的作用机制以1、2、4μmol/LRBG作用HepG2细胞48h后，细胞中线粒体跨膜电位（ψm△）呈浓度依赖性降低，细胞中抑凋亡蛋白bcl-2表达降低，而促凋亡蛋白Bax的表达增强；胞浆中的Cyt-c和细胞中的caspase-9、3的表达逐渐升高；caspase-8的表达基本无变化。其中以RBG≥2μmol/L时，与空白对照组相比作用显著。WesternBlot实验结果显示，与G2/M期相关的细胞周期蛋白p53、p21、PCNA和CyclinB1发生改变。提示：RBG可使细胞周期阻滞在G2/M期。
　　3.3RBG对裸鼠肝癌的治疗作用采用皮下接种HepG2细胞，建立裸鼠移植瘤肝癌模型。接种肝癌HepG2细胞2周后，模型组动物体重明显减轻，精神状况欠佳。与模型组相比，经10mg/kg、5mg/kgRBG及20mg/kg5-FU治疗后，荷瘤小鼠的一般体征有明显改善，体重下降缓慢，下降程度低于模型组。病理学观察发现给药后各脏器未引起炎症反应，且5mg/kg组的疗效好于1mg/kg组。免疫组化法检测发现，模型组瘤组织内Bcl-2阳性表达强度较弱，而Bax蛋白阳性表达较强，阳性对照组Bax蛋白表达未见明显增强；Westernblot法检测结果显示与体外实验结果基本一致，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax的表达增强，细胞中caspase-9、3的表达逐渐升高；caspase-8的表达基本无变化。
　　4、结论
　　采用荧光染色、透射电镜、流式细胞术、WestenBlot和免疫组织化学等研究技术，证实RBG对人肝癌HepG2细胞增殖及皮下接种肝癌HepG2细胞诱发的肿瘤均具有显著抑制作用。其可能的作用机制是通过调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达、降低线粒体跨膜电位、促使线粒体中Cyt-c释放，刺激Caspase-8和Caspase-9的活化，进而激活caspase-3，引发Caspase级联反应，诱导HepG2细胞发生凋亡。

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文献回顾

1 肝癌的研究进展

2 脂蟾毒配基的研究进展

3 细胞凋亡通路及相关蛋白

正文

第一部分 脂蟾毒配基对细胞株的 MTT 筛选及抑制肝癌 HepG2 细胞增殖研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第二部分 脂蟾毒配基对肝癌 HepG2 细胞作用机制研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

第三部分 脂蟾毒配基对裸鼠肝癌皮下移植瘤的作用探讨

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

5 结论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢