不同孔径的磷酸钙骨水泥对大鼠骨髓间充质干细胞生物相容性影响差异的研究

摘要

背景：大段骨缺损的修复一直是临床上所面临的难题，骨组织工程的研究和发展为大段骨缺损的修复提供了一条良好的途径，相关实验研究报道利用支架材料复合生长因子以及种子细胞配合适宜的体内力学环境可有效的修复大段骨缺损模型，但是不同结构、组成的支架材料植入体内后新生骨组织长入速率存在很大的差异。研究表明，材料结构可以明显影响骨组织的长入速度，而孔隙率和孔径大小又是其中最为重要的影响因素。因此研究不同孔径大小的支架材料对大段骨缺损的治疗显得尤为重要。本研究采用三种孔径大小(200-300μm、300-450μm、450-600μm)的磷酸钙骨水泥材料与骨髓间充质干细胞在体外共同培养的方法，观察材料表面的细胞黏附、增殖和分化能力的差异，分析材料孔径结构在促进骨折愈合机制中的作用。
　　实验一CPC材料的孔径大小与大鼠骨髓间充质干细胞黏附能力之间的关系
　　目的：评价不同大小孔径的磷酸钙骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料对大鼠骨髓间充质干细胞(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)黏附能力的影响。方法：用盐析法制备三种不同孔径的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料，利用Micro-CT测量三种材料的平均孔径、孔隙率。无菌条件下取新生大鼠BMSCs原代培养并传代；将三组材料分别放置于24孔板内，每个材料接种2×105个细胞后，37℃、饱和湿度环境下静置培养。于接种后第12h、24h收集细胞并计数，计算细胞黏附率；并在第24h收集细胞行AnnexinVFITC/PI双标记，流式细胞仪检测细胞凋亡、坏死检测，并利用扫描电镜观察细胞形态及黏附情况。结果：micro-CT测量结果显示：三种CPC材料孔径间相互连通，孔隙率均大于67％，平均孔径分别为240μm、410μm、510μm。第12h，三种材料表面细胞黏附率及坏死率均无明显差别(P＞0.05)；200-300μm组在第24h细胞黏附量明显少于300-450μm组和450-600μm组，差值具有统计学意义(P＜0.05)；200-300μm组材料表面细胞坏死数量明显多于450-600μm组，(P＜0.05)。结论：孔径大小可影响大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的黏附能力，随着孔径增大，细胞黏附率逐渐增高，细胞坏死率逐渐降低。本实验为进一步研究孔径结构对细胞的增殖、分化提供了实验依据。
　　实验二不同孔径CPC材料对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响
　　目的：评价不同大小孔径的磷酸钙骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料对大鼠骨髓间充质干细胞增殖能力的影响。方法：将三种不同孔径的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料分为三组，每个材料接种P3代大鼠间充质干细胞5×104个细胞，37℃、饱和湿度环境下静置培养。于接种后第1、4、7、14、21天用PICOGREEN细胞繁殖定量检测试剂盒测定细胞增殖率，并在第14天、21天用戊二醛固定材料，梯度脱水、干燥喷金，利用扫描电镜观察材料表面细胞生长情况。结果：细胞在三组材料上均呈对数增长趋势，第14天左右即到达平台期，在第1天三组细胞数量无明显差异，第4天大孔径(450-600μm)材料组细胞数量明显高于其余两组(P＜0.05)，在第7天细胞数量随孔径的增加依次增加，3组间均有统计学差异(P＜0.05)，第14天和第21天200-300μm组细胞数量明显少于其余两组(300～450μm、450～600μm)(P＜0.05)，300-450μm组和450-600μm组间无统计学差异(P＞0.05)。结论：材料孔径结构可影响大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的增殖能力，大孔径材料较小孔径材料更利于细胞增殖。为进一步研究孔径结构对细胞的成骨分化提供了实验依据。
　　实验三不同孔径CPC材料对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
　　目的：评价不同大小孔径的磷酸钙骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法：将三种不同孔径的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料分为三组，每个材料接种P3代大鼠间充质干细胞5×104个细胞，37℃、饱和湿度环境下静置，成骨培养基诱导培养。于接种后第47、14、21天用ALP活性测定试剂盒测定细胞ALP活性；并提取总RNA，qRT-PCR测定成骨相关基因的表达。结果：通过碱性磷酸酶活性测定以及qRT-PCR测定5对成骨基因显示：在200-300μm孔径CPC材料组表面细胞成骨分化程度明显好于其余两组(P＜0.05)。结论：材料的孔径大小可影响大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的成骨分化能力，小孔径材料较大孔径材料更利于细胞向成骨相分化。

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前言

文献回顾

1 孔径结构的重要性

2.孔径结构在不同生物材料中的作用

3 孔径结构对成骨的影响

4 孔径结构对力学强度的影响

5 展望

正文

实验一 CPC 材料的孔径大小与大鼠骨髓间充质干细胞黏附能力之间的关系

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验二 不同孔径 CPC 材料对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验三 不同孔径 CPC 材料对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢