siRNA抑制p53、p21表达后对髓核细胞衰老凋亡的影响

摘要

随着机体老化，椎间盘退行性变的过程伴随明显细胞生物学的改变，包括椎间盘细胞衰老、细胞凋亡、细胞增殖、细胞类型、细胞数量、细胞密度等的改变。发生退行性变的人椎间盘细胞表达细胞衰老相关β-半乳糖苷酶，尤其在退变脱出的髓核组织其表达明显增高，且随着椎间盘退行性变分级的增高其细胞衰老标志物SA-β-gal的表达明显增加，另外，从退行性变椎间盘组织分离培养的髓核细胞增殖活性明显低于非退变椎间盘体外分离培养的髓核细胞，且退行性变椎间盘细胞衰老明显多于非退变椎间盘细胞。这些研究发现均提示椎间盘髓核细胞衰老退变在椎间盘退行性变的过程中发挥重要作用。
　　另外椎间盘退行性变导致纤维环破裂从而不同程度改变了椎间盘周围组织外环境，退行性变椎间盘组织新生血管形成改善了椎间盘组织低氧环境，且带来细胞因子，增殖活性部分提高的椎间盘细胞暴露于椎间盘组织新生血管形成的高氧环境及细胞因子，进一步促进髓核细胞复制性衰老或应激诱导的过早衰老的发生。总之，髓核细胞衰老在椎间盘退行性变的过程中扮演重要角色，椎间盘退行性变的过程中其细胞生物学改变及其相互作用是及其复杂的过程。因此抑制髓核细胞的衰老可能是椎间盘退行性变的一种潜在生物学治疗方法。
　　研究目的：
　　1．探讨Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离培养髓核细胞可行性，髓核细胞表型分子的初步鉴定。
　　2．探讨siRNA抑制p53、p21的表达延缓髓核细胞衰老、改善椎间盘退变的可行性。
　　研究方法：
　　1．采用Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶消化分离髓核细胞并连续培养，免疫细胞化学染色检测髓核细胞HIF-1、MMP-2、Ⅱ型胶原的表达。
　　2.传代培养髓核细胞转染p53、p21siRNA抑制p53、p21的表达后RT-PCR及Westernblot检测沉默效率，SA-β-gal染色检测p53、p21受抑制前后髓核细胞衰老发生率的变化。
　　3.流式细胞术及MTT法分别检测髓核细胞p53、p21受抑制前后细胞周期及髓核细胞生长曲线。
　　研究结果：
　　1.Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶分离培养的原代髓核细胞需要12d左右贴壁，达95％融合需要34d，而传代髓核细胞贴壁速率明显增快至10h，且其倍增时间约为2.5d；免疫细胞化学染色显示髓核细胞均表达HIF-1α、HIF-1β、MMP-2及Ⅱ型胶原，其表达量明显有别于周围纤维环细胞。
　　2.RT-PCR及Westernblot证实髓核细胞转染p53、p21siRNA后p53、p21的表达明显受到抑制，SA-β-gal染色显示转染组SA-β-gal阳性率明显低于正常对照组。结果显示抑制p53、p21的表达可改善髓核细胞的衰老。
　　3.细胞周期分析显示髓核细胞转染组G1期明显低于正常对照组，而转染组S期均明显高于正常对照组。MTT法髓核细胞生长曲线分析显示随着髓核细胞传代其增殖逐渐减缓，而转染p53、p21siRNA后的髓核细胞增殖明显增快，对数期倍增时间缩短。结果提示抑制p53、p21的表达后可一定程度改善髓核细胞周期、促进髓核细胞生长变化。
　　结论：
　　1.Ⅱ型胶原酶联合透明质酸酶可成功分离培养髓核细胞，提高细胞培养效率；HIF-1α、HIF-1β、Ⅱ型胶原及MMP2可结合应用作为髓核细胞表型分子用于髓核细胞的初步鉴定。
　　2.抑制p53、p21的表达可以改善髓核细胞衰老的发生，一定程度上改善发生退行性变髓核细胞的细胞生物学。
　　3.抑制p53、p21的表达可以通过调节细胞周期而改善髓核细胞衰老退变、促进髓核细胞生长增殖，从而可能改善椎间盘退行性变的过程，因此抑制p53、p21基因表达可能是治疗椎间盘退行性变的潜在有效生物学方法。

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文献回顾

1. 椎间盘退行性变的机制研究进展

2. 髓核细胞表型分子研究进展

3. 髓核细胞衰老凋亡在椎间盘退行性变过程中的作用

正文

实验一 髓核细胞原代培养及表型分子初步鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 髓核细胞增殖及衰老凋亡检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 siRNA 抑制 p53、p21 表达后对髓核细胞衰老凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢