汉滩病毒感染HaCaT细胞诱导Ⅰ型干扰素产生及其分子机制的初步研究

摘要

汉坦病毒(Hantavirus)是布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属(Hantaviruses)家族成员,其基因组由大(L)、中(M)和小(S)三条单股负链RNA组成。L片段编码RNA依赖的RNA聚合酶(Pol),S片段编码病毒核衣壳蛋白(neucleocapsidprotein,NP),M片段编码病毒的糖蛋白前体。汉坦病毒属的汉滩病毒(Hantaanvirus,HTNV)、汉城病毒(Seoulvirus,SEOV)、普马拉病毒(Puumalavirus,PUUV)等感染引起的肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)主要流行于亚洲和欧洲国家;安第斯病毒(Andesvirus,ANDV)、纽约病毒(NewYorkvirus,NYV)和辛诺柏病毒(SinNombrevirus,SNV)等引起的汉坦病毒肺综合征(hantavirus pulmonary syndrome,HPS)主要流行于美洲国家,两者均属于病死率较高和病情较为严重的急性传染病。我国是HFRS的流行大国,发病人数居全球首位。其临床特征主要以发热、出血、低血压休克和急性肾脏功能损伤为主。
　　HFRS的发病机制及病理过程较为复杂。目前研究认为病毒一方面可直接感染脏器组织致使结构和功能异常,另一方面病毒感染机体激活机体的固有免疫应答和适应性免疫应答,致使机体内环境发生变化,释放炎症介质、血管活性因子和多种细胞因子,而最终导致机体内环境紊乱和器官功能失调。
　　汉坦病毒的主要存储宿主是啮齿类动物。其传播途径多样,一般认为是人通过接触带毒啮齿类动物的排泄物与分泌物经伤口、气溶胶、饮食而感染,其中被带毒啮齿类动物轻微咬伤也可导致感染,而关于咬伤引起病毒感染的细胞学基础及发生的详细分子事件尚不清楚。皮肤角质形成细胞(keratinocyte,KC)是人表皮组织的主要组成细胞,也被认为是具有重要功能的非专业性抗原呈递细胞(antigenpresentingcell,APC),可分泌众多细胞因子如干扰素、白细胞介素(IL-1α、IL-1β、IL-3、IL-7、IL-8、IL-10、IL-l8等)、集落刺激因子(G-CSF、GM-CSF)、肿瘤坏死因子、生长因子、趋化因子等来抑制外来病原体的感染,也可通过表达MHCⅡ类抗原、吞噬加工抗原等参与抗原递呈而发挥免疫防御作用。我们推测在经带毒啮齿类动物咬伤而感染汉坦病毒这一过程中,病毒有可能感染人KC细胞并诱导机体的固有免疫应答与炎症反应,为控制病毒感染或病毒的进一步扩散提供可能。为此,本研究以永生化的人角质形成细胞系(HaCaT细胞,具有正常角质形成细胞的全部特性)为研究模型,观察HTNV是否感染KC细胞,以及感染KC细胞之后能否激活Ⅰ型干扰素固有免疫应答以应对病毒感染,并进一步探讨Ⅰ型干扰素应答中存在的可能机制,为阐明汉坦病毒感染致病过程中KC细胞可能作为一种潜在的靶细胞及发生的分子事件提供实验依据。
　　主要实验方法和研究结果：
　　1.HTNV可感染HaCaT细胞,并能够在其中复制增殖
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT细胞,6h和24h时分别收集细胞,在对细胞裂解物进行蛋白定量后,以核蛋白(nucleocapsidprotein,NP)的单抗为一抗,采用Westernblot检测其中病毒的NP。结果显示,病毒感染组在6h和24h均检测到特异条带,与NP的预期大小一致,而且24h的条带明显较强,未加病毒感染的对照组6h和24h均未检测到相应的特异条带。以NP的单抗为一抗,用免疫荧光法检测病毒感染72h时细胞内病毒的NP,结果显示,在胞浆中观察到较强的特异性绿色荧光,即NP有特异的表达;未加病毒对照组中,胞浆内没有观察到特异的绿色荧光颗粒。以上结果表明,HTNV可感染HaCaT细胞,并能够在其中复制增殖。
　　2.HTNV感染HaCaT细胞后可诱导表达IFNβ
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT细胞后,于1d和3d分别收集细胞,qRT-PCR分别检测Ⅰ型干扰素IFNα和IFNβ的mRNA。结果显示,与未感染对照组相比,病毒感染后细胞内IFNβmRNA水平在1d和3d时均显著升高,而IFNαmRNA水平在1d和3d时变化均不明显。结果表明,HTNV感染HaCaT细胞诱导了Ⅰ型干扰素的产生,且以IFNβ为主。
　　3.HTNV感染HaCaT细胞可激活IFNβ启动子
　　用Lipofectamine2000介导pRL-TK和含IFNβ启动子的重组质粒IF△116共转染HaCaT细胞,于6h后进行HTNV感染,24h后检测荧光素酶活性。结果显示,重组质粒IF△116转染HaCaT细胞后经HTNV感染,与未感染的细胞组相比荧光素酶活性明显增强。该结果提示,HTNV感染后能明显激活IFNβ启动子。
　　4.HTNV感染HaCaT细胞可激活Ⅰ型干扰素应答通路中相关效应分子
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT细胞2h后继续培养,于不同时间点分别收集细胞,并提取细胞RNA后进行反转录,qRT-PCR分别检测了Ⅰ型干扰素应答通路中关键分子的表达水平。
　　模式识别受体(PRR)检测结果显示,与未感染对照组相比,病毒感染细胞组RIG-Ⅰ的mRNA水平在1d和3d时均显著升高;MDA5的mRNA水平在1d时变化不明显,在3d时mRNA水平显著升高;而病毒感染细胞TLR3的mRNA水平在1d和3d时均无明显升高。该结果表明,在HTNV激活的干扰素应答通路中,RIG-Ⅰ可能在病毒感染初期参与了HTNV的识别过程并进一步激活了下游信号转导通路;随后RIG-Ⅰ和MDA5在介导细胞内信号应答过程中共同发挥了重要作用;TLR3可能不参与HTNV感染HaCaT细胞的识别过程。
　　转录因子IRF3和IRF7检测结果显示,与病毒未感染对照组相比,病毒感染细胞组IRF3和IRF7的mRNA水平在1d时变化均不明显,3d时二者的mRNA水平均明显升高,其中IRF7的mRNA水平上调更为显著;在病毒感染HaCaT细胞4h、6h和24h时,免疫荧光法检测IRF3、IRF7和NF-κB/p65入核情况,结果显示在感染6h时,细胞核内能观察到明显的IRF3绿色荧光,而IRF3在4h和24h时,IRF7和NF-κB/p65在4h、6h和24h时均未观察到细胞核内有绿色荧光;随后的双荧光素酶报告基因系统对NF-κB结合区激活情况检测结果显示,HTNV感染后,NF-κB信号没有被明显激活。以上结果提示,在病毒感染初期,活化的IRF3而非NF-κB可能首先入核介导了早期IFNβ基因的转录和调控,IRF7则可能在随后Ⅰ型干扰素基因的转录调控中发挥主要作用。
　　转录因子STAT1和IRF9检测结果显示,与未感染对照组相比,病毒感染细胞组STAT1及IRF9的mRNA水平在1d时升高均不明显,在3d时二者的mRNA水平均明显升高;病毒感染HaCaT细胞4h、6h和24h时免疫荧光法检测STAT1入核情况时,结果显示在感染细胞24h时核内能观察到明显的绿色荧光,而4h和6h时未观察到核内有绿色荧光;随后用用双荧光素酶报告基因系统对STAT1结合区激活情况进行检测,结果显示,HTNV感染后,STAT1信号被明显激活。以上结果进一步验证了在干扰素诱导生成的下游通路中磷酸化的STAT1和其他转录因子结合形成异三聚体后入核而启动众多ISG基因的转录和合成。
　　干扰素刺激因子(ISG)检测结果显示,与未感染对照组相比,病毒感染细胞组MxA、OAS1和IFIT1的mRNA水平在1d、3d和5d时均显著升高;IFIT3的mRNA水平在1d时升高不明显,在3d和5d时也明显升高。MxA和OAS1的mRNA水平呈先上升后下降趋势;IFIT1和IFIT3的表达呈持续上升趋势。结果表明,HTNV感染的HaCaT细胞诱导产生的MxA和OAS1可能在感染早期发挥主要的抗病毒作用;IFIT1和IFIT3可能在病毒感染后期发挥重要的抗病毒作用。
　　5.HTNV感染HaCaT细胞可诱导表达趋化因子CCL5和CXCL10
　　用MOI=1的HTNV感染HaCaT细胞,同时设病毒未感染对照组,于1d、3d和5d时分别收集细胞,qRT-PCR检测CCL5和CXCL10的mRNA水平。结果显示,HTNV感染后CCL5和CXCL10均被大量诱导表达,且CXCL10在1d时表达较为显著。结果提示,CCL5在其受体的介导下可能主要参与病程后期的病毒清除及炎症反应,而CXCL10可能在感染初期即参与了机体强烈的抗病毒反应。
　　结论：
　　综上所述,HTNV能够感染人角质形成细胞系HaCaT细胞,感染细胞后诱导了IFNβ的产生,IFNβ又可引起细胞产生相应的ISG发挥抗病毒作用,与此同时HTNV感染HaCaT细胞还可产生趋化因子,趋化因子可能参与了机体的抗病毒应答及炎症反应。本研究为进一步探索带毒啮齿类动物咬伤时KC细胞的固有免疫应答机制提供了实验基础。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 材料

1.1 细胞、病毒和质粒

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂及配制

2 方法

2.1 HTNV感染HaCaT细胞及其检测

2.2 HTNV感染HaCaT细胞后Ⅰ型干扰素的检测

2.3 HTNV感染HaCaT细胞后PRRs的mRNA表达水平检测

2.4 HTNV感染HaCaT细胞后IRF3、IRF7和NF-κB的检测

2.5 HTNV感染HaCaT细胞后STAT1和IRF9的检测

2.6 ISG和趋化因子的mRNA表达水平检测

3 结果

3.1 HTNV感染HaCaT细胞的检测结果

3.2 HTNV感染HaCaT细胞后Ⅰ型干扰素的检测结果

3.3 HTNV感染HaCaT细胞后PRRs的mRNA表达水平检测结果

3.4 HTNV感染HaCaT细胞后IRF3、IRF7和NF-κB的检测结果

3.5 HTNV感染HaCaT细胞后STAT1和 IRF9的检测结果

3.6 ISG和趋化因子的mRNA表达水平检测结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢