lncRNA NEAT1调控宿主抗汉滩病毒固有免疫应答分子机制的初步研究

摘要

背景：
　　汉滩病毒（Hantaan virus，HTNV）属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）汉坦病毒科（Hantaviridae），是我国重症肾综合征出血热（hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）的主要病原体。HFRS死亡率为0.1％-15%，迄今尚无针对HTNV感染的特异性药物。以干扰素（interferon,IFN）为核心的固有免疫应答在机体抵御HTNV感染的过程中发挥重要作用，而RIG-I作为宿主细胞的模式识别受体（pathogen recognition receptor,PRR）能够识别病毒的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP），促进机体产生IFN。目前尚不清楚HTNV感染后宿主细胞中RIG-I信号通路的调控机制。近期研究表明长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）可调控PRR等多种固有免疫相关基因的表达，与病毒感染增殖及其所致疾病的发生发展关系密切，但尚无文献报道HTNV感染后宿主lncRNA表达变化及其作用。
　　目的：
　　本研究旨在通过数字基因表达谱（digital gene expression,DGE）分析HTNV-宿主细胞相互作用过程中宿主lncRNA的表达变化，从中筛选出具有抗病毒作用的分子并明确其抗HTNV感染的分子机制，为抗HTNV药物的研发提供理论基础。
　　方法与结果：
　　1.NEAT1正向调控I型IFN信号通路活化进而抑制HTNV感染的作用确定
　　1.1 NEAT1在HTNV感染后表达上调，且其表达与感染时间及感染剂量相关
　　为研究HTNV感染后宿主细胞lncRNA表达变化，将HTNV以MOI=1感染人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs），同时设置Mock组（纯细胞组）、Co60-HTNV组（Co60灭活病毒处理组），24hpi提取RNA进行DGE分析，结果表明与Mock组或Co60-HTNV组相比，HTNV组中NEAT1、GAS5、IPW等多种lncRNA分子表达变化具有统计学意义，其中lncRNA NEAT1表达上调显著。荧光原位杂交（FISH）和实时定量PCR（qRT-PCR）等实验结果证实HTNV感染可在HUVECs、HEK293、A549、HeLa等多种细胞系中诱导NEAT1表达上调，且NEAT1表达上调趋势与感染时间、感染剂量在一定范围内呈正相关。
　　1.2 体外干预NEAT1-2表达可影响宿主细胞IFN产生及HTNV复制
　　为明确 NEAT1在汉坦病毒感染过程中的作用，在HUVECs中分别转染敲减NEAT1的siRNA或过表达NEAT1的质粒，转染24h后以MOI=0.1或1感染HTNV，48hpi进行相关实验。qRT-PCR、Western Blot及in-cell western等实验结果表明，敲减NEAT1-2可促进HTNVS片段复制及HTNV NP表达，而过表达NEAT1-2可抑制HTNV感染。qRT-PCR及ELISA等实验结果表明，敲减NEAT1-2可抑制HTNV感染后宿主细胞IFNβ、IL-8、CCL5的产生，而过表达NEAT1-2则促进HTNV感染后宿主细胞IFNβ、IL-8、CCL5的产生。NEAT1-2敲减条件下使用IFNβ处理细胞可抑制HTNV感染，而NEAT1-2过表达条件下使用IFNβ中和抗体可抑制HTNV感染。上述实验结果提示NEAT1-2可通过正向调控宿主细胞IFNβ产生进而抑制HTNV复制。
　　1.3 体内敲减NEAT1-2可在HTNV感染早期抑制机体IFN产生并加重HTNV感染
　　为进一步研究NEAT1-2在体内对 HTNV感染的影响，通过尾静脉注射siRNA的方式在C57BL/6J小鼠体内敲减NEAT1-2分子，之后感染HTNV，于3dpi进行ELISA、qRT-PCR、HE染色、流式细胞实验（FCM）等实验，结果表明，与NC+HTNV组相比，Si-NEAT1-2+HTNV组小鼠外周血IFNβ水平降低，肝、脾、肾等脏器中HTNVS片段及NP表达升高、病毒滴度增加，各脏器炎症细胞浸润减少但病理损伤加重，其中脾脏中CD11b+F4/80+Mφ、及CD8+IFNγ+T细胞数目减少。
　　2.NEAT1-2与RIG-I信号通路交互作用调控I型IFN信号通路的分子机制研究
　　2.1 HTNV感染通过RIG-I-IRF7信号通路诱导NEAT1-2表达上调
　　上述实验利用细胞及动物感染模型明确了NEAT1-2抗HTNV感染的作用，但尚不清楚HTNV诱导NEAT1上调的分子机制。qRT-PCR实验结果表明，在HUVECs中过表达HTNV NP/Gn/Gc，或使用IFNα/β/γ、IL-1β、TNFα等不同细胞因子刺激HUVECs均不能诱导NEAT1-2上调；在HUVECs中敲减TLR3/4或MDA5亦不能阻遏HTNV感染后NEAT1-2表达，而在HUVECs中敲减RIG-I或IRF7，或在RIG-I敲除的细胞系Huh7.5中，HTNV感染不能诱导NEAT1-2表达，上述实验结果提示HTNV主要通过RIG-I-IRF7信号通路诱导宿主细胞NEAT1-2表达。
　　2.2 NEAT1-2正向调控HTNV感染后RIG-I及DDX60表达间接促进IFNβ表达
　　为了明确NEAT1调控IFNβ表达的作用机制，在HUVECs中敲减NEAT1-2后感染HTNV，qRT-PCR及Western Blot实验结果表明NEAT1-2敲减后宿主细胞的RIG-I及DDX60分子显著下调。为明确RIG-I及DDX60分子在HTNV感染中的作用，在HUVECs中单独敲减RIG-I或DDX60，或共同敲减两者后感染HTNV，qRT-PCR、Western Blot等实验结果表明与NC对照组或单独敲减组相比，共同敲减组IFNβ产生减少，HTNV复制增加；在HUVECs中单独过表达RIG-I或DDX60，或共同过表达两者后感染HTNV，qRT-PCR、Western Blot等实验结果表明与Vector对照组或单独过表达组相比，共同过表达组IFNβ产生增加，HTNV复制减少。上述实验结果提示HTNV感染诱导NEAT1上调，NEAT1可促进RIG-I及DDX60表达，两者协同调控HTNV感染后宿主细胞IFNβ产生，抑制HTNV感染增殖。
　　2.3 NEAT1-2通过募集SFPQ调控RIG-I及DDX60表达间接发挥抗HTNV作用
　　既往生物信息预测结果表明脯氨酸及谷氨酰胺富集剪接因子（the splicing factor proline-glutamine rich,SFPQ）可能结合与RIG-I及DDX60启动子区域进而抑制其转录，而NEAT1-2结合 SFPQ解除其转录抑制作用。为研究NEAT1-2调控RIG-I及DDX60表达的分子机制，通过RNA免疫共沉淀技术（RIP）检测HTNV感染前后NEAT1-2与蛋白SFPQ的结合变化，结果提示HTNV感染后NEAT1与SFPQ结合增加。通过Western Blot、免疫荧光技术（IFA）分别检测SFPQ在HTNV感染前后的蛋白表达量及亚细胞定位变化，结果表明SFPQ在HTNV感染前后表达量并无变化，而在感染前其弥散分布于核内，感染后在核内形成斑点。通过免疫共沉淀技术（Co-IP）检测SFPQ与核旁斑形成蛋白NONO在HTNV感染前后的结合情况，结果显示HTNV感染后SFPQ和NONO结合增加，上述结果提示HTNV感染后核旁斑形成增加。通过qRT-PCR等技术检测SFPQ敲减条件下HUVECs中RIG-I、DDX60分子表达变化及HTNV病毒复制情况，结果表明敲减SFPQ可促进RIG-I及DDX60表达，抑制HTNV感染后S片段复制。上述实验结果提示HTNV感染后NEAT1-2可募集SFPQ形成核旁斑，解除其对RIG-I及DDX60的转录抑制作用，间接发挥抗HTNV感染的功能。
　　3.HFRS患者外周血单核细胞中NEAT1-2表达水平与疾病进展的相关性研究
　　为明确NEAT1-2与HFRS疾病进展的关系，本研究利用阴性选择法分离HFRS患者外周血中的单核细胞（monocytes，Mo），通过qRT-PCR检测 NEAT1-2的表达水平，分析其与疾病病程及病情严重程度的关系，结果表明与健康人或 HFRS恢复期患者相比，HFRS发热期、低血压休克期及少尿期患者外周血Mo中的NEAT1-2水平明显升高。将外周血Mo中NEAT1-2表达水平与患者血清病毒载量、血肌酐（Scr）最高值、血小板数目（PLT）最低值及血白细胞数（WBC）进行回归分析，结果提示NEAT1-2表达水平与外周血病毒载量、Scr最高值呈负相关，与PLT最低值呈正相关，与WBC不存在回归关系。
　　结论：
　　综上，HTNV感染通过RIG-I-IRF7信号通路诱导宿主细胞上调lncRNA NEAT1，而NEAT1通过募集SFPQ形成核旁斑，解除SFPQ对RIG-I、DDX60等分子的转录抑制作用，从而使RIG-I及DDX60协同促进HTNV感染后IFNβ产生，抑制HTNV感染复制。

目录

声明

缩略语表

前言

文献回顾

1. lncRNA 的表达特点及其生物学功能

2. 宿主编码lncRNA调控抗病毒免疫应答

3. 病毒编码lncRNA调控病毒及宿主的基本生物进程

4. 汉坦病毒与宿主细胞的相互作用

第一部分NEAT1正向调控I型IFN信号通路活化进而抑制HTNV感染的作用确定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 NEAT1-2与RIG-I信号通路交互作用调控I型IFN信号通路活化的分子机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 HFRS患者外周血单核细胞中NEAT1-2表达水平与疾病进展的相关性研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢