Wnt信号通路在臂丛神经根性撕脱伤诱发的神经病理性痛中的作用机制研究

摘要

背景：
　　臂丛神经根性撕脱伤（BPA）是一种伴随神经病理性痛（NPP）高发且损伤部位特殊的外伤性周围神经损伤。由于损伤因素会同时累及脊髓背根神经节（DRG）及相应节段损伤侧的脊髓背角（SDH），因此 BPA是周围神经系统和中枢神经系统同时受累的交界性损伤。BPA致伤因素各异，损伤类型繁杂，累及范围广泛，受累及的神经根组合类型多样，因此明确诊断BPA并且制定合理有效的治疗方案对临床医生来说并非易事。更加棘手的是，BPA患者同时伴发NPP等严重并发症的发生率高达90％，然而目前可供临床医生选择的治疗和缓解NPP症状的方法非常有限并且疗效并不理想。近年基础研究结果显示，Wnt信号通路在神经系统发育过程中可发挥多种作用，其下游信号分子活化与突触的形成及结构和功能可塑性的调节密切相关，而突触可塑性改变又与NPP的发生息息相关。那么，Wnt信号通路是否也参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与，其作用机制是什么现在仍不得而知。因此，本课题的研究目的希望能够发现Wnt信号通路是否参与了BPA诱发NPP的过程；如果参与，希望能够进一步揭示Wnt信号通路在BPA诱发NPP过程中的调控机制，为临床治疗BPA合并NPP患者提供基础理论支持，进一步探索出治疗和缓解此类患者疼痛症状的新思路或治疗切入点。
　　目的：
　　1.建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛（BPA-NPP）大鼠模型，并对其进行行为学和分子生物学鉴定。
　　2.检测Wnt信号通路相关分子在BPA-NPP模型组大鼠SDH中的表达和定位，进一步观察该通路对神经胶质细胞活化以及神经元突触可塑性的影响。
　　3.探究抑制Wnt信号通路对BPA-NPP大鼠神经病理性痛行为学和SDH突触可塑性的影响。
　　4.观察Wnt信号通路分子在BPA-NPP大鼠背根神经节（DRG）神经元中的表达，进一步探究其对钠离子信号通路Nav1.8表达的调控机制。
　　方法：
　　1、撕脱大鼠臂丛神经C8和T1神经根，建立臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛（BPA-NPP）大鼠模型。利用von Frey纤维丝检测大鼠BPA损伤后机械性缩足阈值的改变；运用Hargreaves热辐射法检测大鼠BPA损伤后热缩足潜伏期的改变；运用丙酮喷雾实验进行大鼠BPA损伤后冷痛敏评分；根据旷场实验进行大鼠自主活动能力评价。Western blotting检测大鼠SDH和DRG中pERK的表达，免疫组织荧光三重标记观察c-Fos的表达。
　　2、RT-PCR、Western blotting、免疫荧光双重标记检测BPA-NPP大鼠模型SDH和DRG中Wnt信号通路相关分子（Wnt-3a、Frizzled4和β-catenin）的表达以及定位。Western blotting检测突触可塑性相关分子的磷酸化水平、Nav1.8、CCL2以及CCR2表达的变化。
　　3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予不同剂量Wnt信号抑制剂IWP-2或氯硝柳胺（Nsm），再观察对大鼠行为学、SDH和DRG区域星形胶质细胞活化情况以及突触可塑性相关分子表达的影响。
　　4、免疫组织荧光化学法检测神经胶质细胞活化标记分子（GFAP）与脊髓浅层突触形成相关蛋白（PSD-95和突触素）的表达。RT-PCR检测炎症因子的mRNA水平。全细胞膜片钳技术记录大鼠SDH浅层神经元微小兴奋性突触后电流（mEPSCs）以及Nav1.8电流的变化。
　　结果：
　　1、成功建立BPA-NPP大鼠模型。BPA损伤术后，大鼠术侧和对侧机械性缩足阈值降低，热缩足潜伏期（TWL）无明显变化，冷痛敏评分升高，自主活动能力无显著变化，且这种NPP的行为学变化至少可以持续至BPA术后28天。BPA-NPP组大鼠SDH和DRG中损伤相关分子pERK表达上调，SDH神经元活化标志分子c-Fos的表达增加。
　　2、BPA-NPP大鼠SDH中Wnt-3a及其受体Frizzled4和下游效应分子β-catenin表达上调，Wnt-3a主要表达于SDH星形胶质细胞和神经元中，而Frizzled4和β-catenin则集中表达于神经元中。同时BPA损伤引起突触可塑性相关分子（CaMKⅡ，谷氨酸能受体亚型NR2B、CREB、PKC等）表达升高。
　　3、BPA-NPP大鼠鞘内置管给予Wnt信号抑制剂IWP-2后，机械性缩足阈值升高，此效应可以维持约9天。IWP-2抑制Wnt信号后，星形胶质细胞活化减少，细胞促炎因子（IL-1β，IL-6和TNF-α）水平显著降低，突触可塑性变化相关分子的磷酸化水平降低，SDH浅层新生突触形成相关蛋白PSD-95和突触素下调，同时SDH浅层神经元mEPSCs受到抑制。
　　4. BPA-NPP大鼠DRG中Wnt-3a、Frizzled4和β-catenin表达上调，同时CCL2及其受体CCR2以及Nav1.8表达上调，IWP-2抑制CCR2和Nav1.8的表达而不影响CCL2的产生，CCR2拮抗剂可降低Nav1.8的表达以及电流。
　　结论：
　　1. BPA损伤引起大鼠SDH和DRG中Wnt/β-catenin信号通路分子表达上调。
　　2. BPA损伤导致大鼠SDH神经胶质细胞活化，促炎因子表达升高，同时活化的Wnt信号通路引起SDH神经元突触可塑性增加，痛敏阈值降低。
　　3. CCL2/CCR2以及Nav1.8参与BPA损伤后DRG感觉神经元疼痛信号的传导，Wnt/β-catenin信号通路通过上调CCR2可增加Nav1.8从而引起NPP的发生。
　　4. Wnt信号通路活化引起的SDH神经元突触可塑性的改变以及Nav1.8离子通道的激活对BPA后NPP的产生发挥重要作用。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分：臂丛神经根性撕脱伤

第二部分 神经病理性痛发生的机制

第三部分 神经胶质细胞与突触可塑性和神经病理性痛之间的关系

第四部分 Wnt信号通路与突触可塑性之间的关系

第一部分 臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛大鼠模型的建立以及行为学和分子生物学鉴定

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 Wnt信号通路相关分子在BPA-NPP模型大鼠脊髓背角中的表达及作用机制

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 干预Wnt-3a分子对臂丛神经根性撕脱伤诱发神经病理性痛的作用和突触可塑性影响

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四部分 Wnt/β-catenin信号分子在BPA-NPP模型大鼠背根神经节中的表达及作用机制

前言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢