21-羟化酶缺陷症基因诊断方法的建立及应用

摘要

目的：
　　通过荧光偏振检测技术联合直接测序法，建立一种针对21-羟化酶缺陷症进行基因诊断的新方法，并用新建立的检测体系对中国人群中21-羟化酶缺陷症最常见的2种基因缺失和8种基因点突变进行检测，验证该体系的准确性及临床可实施性，并对检测到的基因突变进行分析，探讨基因型与临床表型之间的关系。
　　方法：
　　收集40例正常人及3例21-羟化酶缺陷症患者外周血，提取基因组DNA。设计通用引物，同时扩增 CYP21A2和CYP21A1P等位基因片段，然后用扩增产物与特异的 TAMRA荧光标记探针分别进行杂交，利用荧光偏振仪检测杂交产物的荧光偏振值(FP)，从而确定是否存在该基因的缺失，同时用直接测序法验证检测结果；对Exon3 Del8bp(GAGACTAC)缺失进行检测时，为确保引物特异性，将缺失的8个碱基设计在引物上，同时根据 CYP21A2基因与其假基因 CYP21A1P部分序列之间的差异，设计5对特异性引物用于扩增CYP21A2基因，PCR后直接测序检测中国人群中21-羟化酶缺陷症最常见的8种基因点突变，即P30L、i2g、I172N、E6Cluster、V281L、920-921insT、Q218X、R356W突变。
　　结果：
　　荧光偏振法未检测到CYP21A2基因大片段缺失，检测结果与直接测序法一致率达100％。40例正常人均无点突变，21-羟化酶缺陷症患者中1例检测出 G56R、c.920-921InsT杂合突变，2例检测出I172N、Q318X杂合突变。
　　结论：
　　本研究初步建立了基于荧光偏振技术联合直接测序法的检测体系，为21-羟化酶缺陷症患者的基因诊断提供了新的方法，不仅能对患者基因突变类型进行分析，并且能指导遗传咨询，为产前诊断提供依据。本方法操作简单，结果准确，费用低廉，有比较乐观的临床应用前景，可以广泛应用于临床。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 先天性肾上腺皮质增生症简介

1.1 CYP21缺陷症

1.2 CYP11B缺陷症

1.3 CYP17A缺陷症

1.4 3β-羟类固醇脱氢酶缺陷症（3β-HSD缺陷症）

1.5 StAR缺陷症

2荧光偏振（Fluorescence polarization,FP）

3 本工作的研究价值和临床意义

第一部分 CYP21A2基因突变检测方法的建立

1 对象及材料

1.1 对象

1.2 材料

2 方法

2.1 抽提血液基因组DNA

2.2 引物及探针设计

2.3 荧光偏振检测分析标准品的构建

2.4 建立荧光偏振检测方法

2.5 建立点突变检测体系

2.6 统计分析

3 结果

3.1 标准品的验证

3.2 荧光偏振检测反应的FP临界值的建立

3.3 荧光偏振检测反应条件优化结果

3.4 荧光偏振检测的稳定性分析

3.5 荧光偏振检测与直接测序法对比

3.6 CYP21A2基因点突变的检测

4 讨论

第二部分 3例21-OHD患者CYP21A2基因突变检测研究

1 材料

1.1 主要仪器及设备

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂配制

2 对象及方法

2.1 对象 收集3例21-OHD患者血液标本。

2.2 方法

3 结果

3.1 荧光偏振检测结果

3.2 荧光偏振检测结果与测序法结果对比

3.3 CYP21A2基因点突变检测结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢