银屑病患者CD8+T细胞的表型鉴定及其作用研究

摘要

银屑病（Psoriasis）是一种具有多基因遗传背景的慢性炎症性皮肤病，目前，银屑病的病因及发病机制尚不清楚，也缺乏满意的针对性治疗方法，该疾病常反复发作，难以根治，严重影响着患者的生活质量。近年研究发现，自身免疫紊乱、角质形成细胞生物学行为异常等在银屑病发病中均发挥着一定的作用。其中，T细胞在银屑病的发病机制中起到至关重要的作用，其异常活化是银屑病发病的重要环节。
　　目的:
　　观察银屑病患者皮损和外周血中CD8+T细胞亚群的比例，并探讨不同亚群在银屑病发病机制中的作用。
　　方法:
　　收集10例银屑病患者皮损、8例扁平苔藓患者皮损及10例健康对照组皮肤，采用免疫组化技术和免疫荧光技术观察CD8α、CD8β、颗粒酶B（GranzymeB）、穿孔素（Perforin）及CD107a的表达分布；同时收集40例银屑病患者、20例扁平苔藓患者及40例健康对照组外周血，采用流式细胞术（Flow cytometry，FCM）分别检测CD8α+α+T细胞和CD8α+β+T细胞比例，并观察CD8α+α+T细胞和CD8α+β+T细胞亚群分泌干扰素γ（Interferon-γ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、颗粒酶B及穿孔素的水平。采用Graph pad Prism统计软件对实验组和对照组各数据进行t检验分析。
　　结果:
　　首先，免疫组化和免疫荧光结果显示银屑病患者皮损表皮和真皮浅层有CD8+T细胞浸润，且以CD8α+α+T细胞亚群为主，而健康对照组皮肤中未见CD8α和CD8β的表达。其次，流式细胞仪检测，健康对照组外周血中CD8α+α+T细胞比例为12.26％±2.35%，CD8α+β+T细胞的比例为82.74%±2.35%；银屑病外周血中CD8α+α+T细胞比例为29.48%±3.20%，CD8α+β+T细胞的比例为67.10%±3.77%。银屑病患者外周血中CD8α+α+T细胞比例明显高于健康对照组，并具有统计学差异（t=3.08，P＜0.01），而银屑病患者外周血中 CD8α+β+ T细胞比例较健康对照组相比明显下降，并具有统计学差异（t=3.52，P＜0.01）。此外，在银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞中分泌 IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为45.67%±6.83%和54.14%±6.69%，CD8α+β+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为26.25%±4.25%和23.56%±4.72%；健康对照组外周血CD8α+α+ T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为13.44%±3.26%和34.03%±6.09%，CD8α+β+T细胞中分泌IFN-γ和TNF-α的细胞比例分别为5.69%±1.40%和13.45%±2.25%。银屑病患者和健康对照外周血中CD8α+α+T细胞表达IFN-γ和TNF-α的比例均高于CD8α+β+T细胞，具有统计学差异（银屑病患者组t值分别为2.41和3.74，P值分别＜0.05和＜0.01；健康对照组t值分别为2.19和3.1，P值均＜0.05）。银屑病患者CD8α+α+T细胞和CD8α+β+ T细胞中表达IFN-γ和TNF-α的比例均明显高于健康对照组。再次，在银屑病患者皮损和扁平苔藓患者皮损中均可见CD8α和颗粒酶B、CD8α和穿孔素的共表达，而在健康对照组皮肤中均未见CD8α和颗粒酶B、CD8α和穿孔素的共表达；在银屑病患者、扁平苔藓患者和健康对照组外周血CD8α+α+ T细胞中颗粒酶B的表达均明显高于CD8α+β+ T细胞，具有统计学差异（t值分别为3.57、3.16和2.77；P值分别＜0.01、＜0.01和＜0.05）；银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞中颗粒酶B的表达水平明显高于扁平苔藓患者组，具有统计学差异（t值为2.88；P值＜0.05）；余两两间无明显差异。穿孔素的表达在银屑病患者外周血 CD8α+β+ T细胞中明显高于健康对照组，具有统计学差异（t值为2.17，P值＜0.05）；而银屑病患者及扁平苔藓患者外周血CD8α+α+ T细胞中穿孔素表达较CD8α+β+ T细胞有一定升高，但无统计学差异，考虑和样本量较少有关。最后，在扁平苔藓患者皮损真皮浅层均可见CD107a表达，但是CD107a与CD8α仅有个别共表达；而在银屑病患者皮损和健康对照组皮肤全层均未见CD107a表达。
　　结论:
　　CD8+T细胞参与银屑病的发病过程，其中CD8α+α+T细胞可能是参与银屑病炎症反应的主要CD8+T细胞亚群，并主要通过分泌IFN-γ和TNF-α等相关细胞因子发挥作用。银屑病患者CD8+T细胞均不同程度地表达杀伤物质颗粒酶B和穿孔素，但在组织水平并未观察到杀伤现象，其具体意义和机制有待进一步研究。

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前言

文献回顾

一、银屑病发病的主要机制

二、T细胞亚群在银屑病发病中的作用

三、CD8+T细胞在银屑病发病中的作用

1 材料与仪器

1.1 主要仪器设备和耗材

1.2 主要试剂

1.3 主要试剂配制

2 实验方法

2.1 临床样本收集

2.2 外周血单个核细胞（ PBMC）分离

2.3 细胞复苏 、培养及刺激

2.4 免疫组化

2.5 免疫荧光

2.6 流式细胞染色及分析

2.7 实验数据分析

3 结果

3.1 银屑病皮损存在以CD8α+α+T为主的CD8+T细胞浸润

3.2 银屑病患者外周血中CD8α+α+T细胞比例明显增高

3.3 银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞大量表达IFN-γ和TNF-α

3.4 银屑病皮损CD8+T细胞表达颗粒酶B和穿孔素

3.5 银屑病患者外周血CD8α+α+T细胞表达颗粒酶B和穿孔素

3.6 银屑病皮损CD8+T细胞不表达杀伤性T细胞的活化标志CD107a

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢