HMGB1表达下调对胃癌细胞生物学功能的影响及初步分子机制探讨

摘要

研究背景：
　　1973年，一组在电泳下具有高迁移率的非组蛋白核蛋白被发现并且被命名为高迁移率族（high-mobility group HMG）蛋白，高迁移率族蛋白1（high mobility group box-1 protein HMGB1）是其中含量最丰富并且研究最充分的HMG蛋白。HMGB1在多种人类疾病中，尤其是在肿瘤及炎症性疾病中扮演重要角色。HMGB1在胞内不仅是DNA分子伴侣、染色体监管者、细胞自噬维持者、凋亡细胞的保护者，并且在细胞外 HMGB1可以发挥细胞因子，趋化因子和生长因子活性，参与炎症和免疫应答反应。HMGB1功能缺陷与肿瘤演进的每一种标志均相关，并且在肿瘤的发生及发展中发挥作用。HMGB1的这些特征使其成为肿瘤研究中的重要分子靶点。尽管如此，目前在胃癌中HMGB1的生物学作用及其分子机制仍知之甚少。
　　目的：
　　检测慢病毒载体干扰HMGB1表达后，胃癌细胞系SGC-7901的生物学活性，利用基因芯片技术筛选潜在下游作用因子，并进行Western blot实验初步验证。
　　方法：
　　针对4个HMGB1靶点序列设计特异性干扰shRNA小分子（HMGB1-shRNA1，HMGB1-shRNA2，HMGB1-shRNA3，HMGB1-shRNA4），分别构建慢病毒转染载体GV115-HMGB1-KD1（KD1）、GV115-HMGB1-KD2（KD2）、GV115-HMGB1-KD3（KD3）、GV115-HMGB1-KD4（KD4），并构建阴性对照载体GV115-HMGB1-NC（NC）。分别通过Lipofectamine2000转染SGC-7901细胞。RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1的表达。胃癌细胞的生物学行为通过下述实验方法分析：MTT实验和BrdU实验检测增殖，克隆形成实验检测克隆数，流式细胞实验检测细胞周期和凋亡。Transwell实验检测迁移。用敲减组及阴性病毒对照组通过基因芯片技术探索下游基因。选择下游信号通路并进行进一步分析。
　　结果：
　　RT-PCR示KD1、KD2、KD4显著抑制HMGB1的表达（>75％），KD2组抑制效率最高。Western blot实验证实相对于阴性病毒对照组（NC）和空白细胞对照组（CON），KD2组HMGB1表达显著抑制(P<0.05)。MTT实验和BrdU实验证实了与CON组和NC组相比，KD2组显著抑制细胞增殖(P<0.05)。克隆形成实验示KD2组较NC组细胞克隆数减少(P<0.05)。 Transwell实验显示KD2组相对CON组和NC组细胞迁移率受到显著抑制(P<0.05)。相对NC组，KD2组的细胞凋亡率显著增加。流式细胞实验证实了KD2组的S期细胞较NC组细胞数量减少(P<0.05)。基因芯片分析证实了通过抑制HMGB1在胃癌细胞中的表达778种基因上调，587种基因下调。生物信息学分析表明HMGB1可能在胃癌细胞中通过调节MAPK信号通路中的 RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9（JNK2）等因子的表达发挥其生物学作用。
　　结论：
　　HMGB1干扰慢病毒载体构建成功，通过该载体我们得到稳定的HMGB1低表达胃癌细胞，下调 HMGB1可以抑制细胞增殖，克隆形成和迁移，增加细胞凋亡。在胃癌中 HMGB1可能通过调控 MAPK通路中的 RAC1、IL1A、TGFBR2、AKT2、DUSP5、MAPK9（JNK2）等分子发挥生物学作用。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 胃癌的研究背景

2 HMGB1研究背景

3 HMGB1与肿瘤研究现状

4 HMGB1与胃癌的研究现状

实验一HMGB1表达下调胃癌细胞系的建立及鉴定

1材料

2方法

3 结果

4 讨论

实验二HMGB1表达下调对胃癌细胞生物学功能的影响

1 材料

2 方法

3结果

4 讨论

实验三HMGB1表达下调胃癌细胞Affymetrix芯片检测分析

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢