Genistein及其改构体KBU2046抑制结肠癌转移的作用和分子机制研究

摘要

目的：
　　已有研究提示染料木黄酮Genistein可有效抑制前列腺癌的生长和转移，但随着剂量增加会产生毒性和雌激素样副作用。为保留其抗肿瘤活性而削减其毒副作用，前期已在Genistein基础上进行改构得到小分子化合物 KBU2046。本研究旨在探讨Genistein及KBU2046对结肠癌转移的作用及相关分子机制。
　　方法：
　　本课题应用的实验方法具体包括，采用 CCK8试剂盒检测药物对细胞增殖活性的影响；通过平板克隆形成实验检测药物对肿瘤细胞克隆形成能力的影响；通过划痕、transwell侵袭/迁移、高内涵运动试验观察药物对细胞侵袭、运动能力的影响；建立结肠癌原位种植模型，结合小动物活体成像技术评估药物对体内肿瘤生长和转移的作用；通过免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色检测原位肿瘤细胞中增殖标志物Ki67和血管内皮标志物CD34的表达以评估肿瘤细胞增殖能力和瘤内血管形成能力；采用qPCR array筛选药物影响的转移相关基因并通过western blot、qPCR以及IHC染色分别在细胞及动物原位瘤组织中进行验证；在结肠癌患者肿瘤组织中通过IHC分析所得分子和临床指标的相关性；采用Western blot研究药物对细胞内蛋白激酶磷酸化水平的影响。
　　结果：
　　目前已取得的主要结果小结如下：
　　在结肠癌细胞系和正常肠粘膜上皮细胞中，10μM以上 Genistein可抑制细胞增殖活性和克隆形成能力；10μM Genistein可在不产生细胞毒性的前提下抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭和运动能力；KBU2046在剂量高达50μM时仍不对结肠正常细胞或癌细胞产生明显毒性；10μM KBU2046可以有效抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭和运动能力；在裸鼠原位结肠癌种植模型中，Genistein和KBU2046可有效抑制人结肠癌细胞在裸鼠体内的肝/肺转移，而对肿瘤生长并无明显抑制。为探讨两种药物抑制结肠癌转移的分子机制，采用qPCR array对转移相关基因进行了筛选，经体内、外验证，发现Genistein和KBU2046均可抑制FLT4和MMP2的表达。进一步研究还提示结肠癌患者肿瘤组织中FLT4表达与临床分期、淋巴结转移相关，其中高表达FLT4提示预后较差。通过检测结肠癌细胞中经药物处理后蛋白激酶磷酸化水平的变化，发现在相同浓度条件下，Genistein可抑制Akt、Erk1/2、p38 MAPK磷酸化，而KBU2046仅抑制Erk1/2、p38 MAPK磷酸化，且效果较Genistein更强，二者对JNK磷酸化均无明显抑制作用。
　　具体结果如下：
　　在正常肠上皮细胞HIEC、结肠癌细胞HCT116、HT29、SW620中检测不同剂量Genistein对细胞活性的影响，发现Genistein在10μM以上会对结肠细胞产生杀伤活性。为专注于药物对细胞运动的影响，本研究选取10μM进行以下相关实验。通过transwell实验、划痕实验和高内涵运动实验，发现10μM Genistein能有效抑制细胞的侵袭、迁移和运动能力。
　　在明确Genistein可以在体外抑制结肠癌细胞侵袭、迁移和运动的前提下，采用相同的实验方法检测其改构体KBU2046对细胞活性和侵袭、迁移能力的影响，发现在与Genistein相同的浓度下，KBU2046的细胞毒性远低于Genistein，但亦能有效抑制细胞的侵袭和迁移能力。
　　为进一步观察 Genistein和KBU2046对结肠癌体内转移的影响，我们首先通过移植皮下瘤到裸鼠结肠的方法建立了结肠癌原位种植转移模型，并通过小动物成像系统对稳定表达luciferase的HCT116细胞进行定量评估原位肿瘤的大小和肝肺转移的程度。结果发现 Genistein和KBU2046在不影响原位肿瘤生长的条件下，均能在不同程度上抑制肿瘤的远处转移。对原位肿瘤组织中细胞增殖标志物Ki67和血管内皮标志物 CD34的表达进行分析，发现药物并没有显著影响细胞增殖，但可以抑制肿瘤内部新生血管形成，并表现出剂量依赖的趋势。对原位肿瘤大小与肝/肺转移程度进行相关分析没有发现二者之间存在显著相关性。
　　为探讨药物的作用机制，我们通过PCR array对两种药物处理后细胞中转移相关基因的变化进行了检测，并通过qPCR、western blot进行验证，结果发现Genistein和KBU2046均可在不同程度上抑制细胞中MMP2和FLT4的表达水平。进一步通过IHC染色发现在原位肿瘤组织中，Genistein和KBU2046处理后也能引起MMP2和FLT4表达下调。
　　MMPs家族蛋白在肿瘤转移尤其肿瘤侵袭中的研究较为详尽，在多种肿瘤中都有MMP2与转移相关的报道。而FLT4与肿瘤侵袭转移的直接关系尚不明确。目前在多种肿瘤类型中有关其表达与临床病理资料相关性的结果不尽相同。为进一步验证FLT4在结肠癌患者中与肿瘤转移的相关性，我们通过组织芯片在60例结肠癌患者的肿瘤组织及来自同一患者的正常组织中检测了FLT4表达水平，结果发现FLT4在肿瘤组织中表达显著高于正常组织，且其表达水平与恶性程度相关。通过Kaplan-Meier方法进行生存分析发现FLT4表达水平与患者生存成负相关。
　　Genistein作为一种酪氨酸蛋白激酶抑制剂，可以抑制多种蛋白激酶的磷酸化水平。为比较 KBU2046和Genistein作用机制的差异，我们对蛋白激酶磷酸化的改变进行了初步研究。结果发现 Genistein和KBU2046对蛋白激酶磷酸化的影响不尽相同。具体来讲，KBU2046对ERK1/2和p38磷酸化的抑制程度较Genistein显著，但对Akt磷酸化没有明显抑制作用，二者对JNK磷酸化均没有显著影响。
　　结论：
　　Genistein及其改构体KBU2046在体外细胞实验和体内结肠癌原位种植模型中均显示了抑制结肠癌细胞转移的活性；这一作用可能通过抑制转移相关基因MMP2和FLT4表达实现。两种药物在对蛋白激酶活性的抑制上存在差异，提示 KBU2046虽然通过保留Genistein的骨架结构而保留了其抑制肿瘤转移的主要活性，但具体作用机制可能与母体有所不同，这将在以后的工作中进行深入研究。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

第一部分 结肠癌转移的分子机制及治疗现状

第二部分 Genistein的研究现状

第一部分 Genistein对结肠癌细胞生长和侵袭运动的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

第二部分 KBU2046对结肠癌细胞生长和侵袭运动的影响

1材料

2方法

3结果

4讨论

第三部分 Genistein和KBU2046对原位种植结肠癌体内转移的抑制

1材料

2方法

3结果

4讨论

第四部分 Genistein和KBU2046抑制结肠癌转移的分子机制研究

1材料

2方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢