ClC-3氯通道参与TGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究

摘要

研究背景：
　　骨质疏松是临床上最常见的骨代谢疾病之一，主要表现为疼痛、易骨折，严重者可致呼吸功能下降，显著影响病患的生活质量，因而骨质疏松的治疗越来越受到人们的关注。甲状旁腺的主细胞能够分泌PTH，从而来调控骨组织代谢以及来维持机体的钙平衡。然而，PTH能够双向地调节骨组织的代谢。具体言之，间断PTH刺激下，小剂量时能够促进骨组织的形成；持续PTH刺激下，大剂量则可以促进骨组织的吸收。但其具体的作用机制尚未探明，因而未能应用于临床上骨质疏松患者的治疗，因此进一步阐明PTH促进骨形成的机制将为其应用于临床提供更多的理论依据。
　　ClC-3电压门控氯通道存在于成骨谱系细胞中，在对成骨细胞的作用上与 PTH有许多共同点。前期研究发现，PTH刺激能显著上调成骨细胞中 ClC-3的表达。并且PTH能通过ClC-3调节下游成、破骨相关基因的表达，但其分子机制并不十分明确。有研究认为，PTH与TGF-β1在膜受体水平上可相互影响，共同调节骨吸收和骨形成，但其作用机制非常复杂还不清楚。在前期研究中我们发现 ClC-3也参与了成骨细胞中TGF-β1信号的调控，TGF-β可以调节成骨细胞的增殖与分化，其中TGF-β1通过Smad2/3信号调控核心结合蛋白因子Runx2的表达，进而促进成骨作用。由此可见，ClC-3不仅和PTH在骨代谢的调节上有密切关系，还参与了TGF-β1信号的调控。所以，ClC-3如何介导TGF-β1与PTH之间的相互作用关系，还有待进一步研究。本课题旨在研究在PTH间断刺激下，ClC-3氯通道、TGF-β1及下游信号分子之间的相互关系，为进一步深入研究PTH的促成骨分化作用机制提供新的思路。
　　研究目的：
　　本研究旨在通过调节ClC-3氯通道基因及TGF-β1基因的不同表达水平来初步探究ClC-3氯通道在PTH调节成骨分化过程中的作用机制。
　　研究内容：
　　（1）研究在1×10-9 MPTH对MC3T3-E1细胞每隔6小时间断刺激下，分别下调TGF-β1和ClC-3基因表达水平后，观察两者基因、蛋白表达的表达情况。
　　（2）研究在1×10-9 M PTH对MC3T3-E1细胞每隔6小时间断刺激下，分别下调及共同下调TGF-β1和ClC-3基因表达水平后，研究其下游成、破骨相关基因的表达情况。
　　（3）研究在1×10-9 M PTH对MC3T3-E1细胞每隔6小时间断刺激下，分别下调及共同下调TGF-β1和ClC-3基因表达水平后，检测成骨细胞体外矿化能力的变化。研究方法：
　　（1）采用基因转染的方法，分别用特异性siRNA下调成骨细胞MC3T3-E1中TGF-β1及ClC-3基因的表达水平，同时利用Real-Time PCR检测MC3T3-E1细胞中TGF-β1和ClC-3基因表达水平，成、破骨相关基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）表达水平。
　　（2）通过免疫印迹方法及细胞免疫荧光法检测PTH刺激下TGF-β1和ClC-3氯通道蛋白表达的影响，初步分析两者之间的关系。
　　（3）利用茜素红染色及计算钙结节观察成骨诱导培养及PTH刺激培养下各组MC3T3-E1细胞的体外矿化能力。
　　研究结果：
　　（1）10-9 M的PTH间断刺激时，MC3T3-E1细胞中仅下调TGF-β1基因表达后，ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强；仅下调ClC-3氯通道基因后，TGF-β1基因及蛋白表达水平增强。
　　（2）10-9 M的PTH间断刺激时，在分别下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后，成、破骨相关基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）表达水平较对照组明显降低。
　　（3）10-9 M的PTH间断刺激时，共同下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因之后，成、破骨相关基因（Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl）较对照组无明显差异。
　　（4）10-9 M的PTH间断刺激时，成骨诱导液诱导成骨的能力优于PTH刺激，在分别下调ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因表达水平后，MC3T3-E1细胞的体外矿化能力较对照组均下降。在共同下调两者之后，其体外矿化能力较对照组无明显差异。
　　研究结论：
　　（1）在PTH刺激促进MC3T3-E1细胞成骨分化过程中，ClC-3与TGF-β1信号可相互影响。
　　（2）ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因均可响应PTH的间断刺激而发生变化，进而影响下游成、破骨相关基因的表达。
　　（3）不同表达水平的ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因对PTH刺激促进MC3T3-E1成骨分化作用有一定影响。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

第一部分 骨质疏松与甲状旁腺激素的研究进展

第二部分 ClC-3氯通道的研究进展

第三部分 TGF-β与骨代谢的研究进展

第一部分 ClC-3氯通道和TGF-β1在PTH刺激促进MC3T3-E1成骨分化中的相互作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 ClC-3和TGF-β1对PTH促成骨分化中下游成、破骨相关基因表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 ClC-3氯通道及TGF-β1在PTH刺激促成骨细胞体外矿化中的作用

1 材料

2 方法

3 结果ClC-3氯通道介导的PTH刺激促进MC3T3-E1细胞体外矿化的作用

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢