灯盏花乙素对热应激诱导的LLC-PK1细胞损伤的保护作用研究

摘要

热应激能够促进肾脏细胞凋亡，从而提高急性肾损伤和其他肾脏疾病的发病率。灯盏花乙素（Scu）是从灯盏花中分离出来的主要活性成分之一，其解热作用显著。HSP70是HSPs家族中最重要的一种非特异性细胞保护蛋白，尤其对体外培养的细胞具有显著的抗热保护作用。细胞凋亡是细胞为维持内环境稳定，有多种基因控制的一种细胞生理性自行消亡过程，其中Bcl-2具有抗细胞凋亡作用，它能拮抗促凋亡基因-Bax，形成异聚体，阻止线粒体中细胞色素c（cyt-c）的释放，进而抑制下游pro-caspase-3的裂解，最终抑制细胞凋亡。目前，国内外未见有关Scu在热应激条件下对LLC-PK1细胞是否具有保护作用的报道，其解热作用机制更是研究甚少。
　　本研究通过对热应激条件下LLC-PK1细胞进行不同浓度的Scu预处理，探讨Scu对受热应激LLC-PK1细胞Bcl-2、Bax、HSP70、cyt-c和pro-caspase-3表达的影响，揭示Scu是否具有保护热应激引起的猪近端小管肾细胞（LLC-PK1）的损伤的作用并探究其保护机制。qRT-PCR及Western blot检测热应激下LLC-PK1细胞Bcl-2/Bax比值，胞浆中cyt-c的含量以及pro-caspase-3的表达，发现热应激下细胞Bcl-2/Bax比值显著（P<0.05）下降，胞浆中cyt-c的含量显著（P<0.05）升高，pro-caspase-3的表达显著（P<0.05）下降，确定热应激对细胞有损伤；然后将热应激LLC-PK1细胞随机分成4组：42℃热应激对照组；42℃热应激，10-5 mol/L Scu预处理组；42℃热应激，10-6 mol/L Scu预处理组；42℃热应激，10-7 mol/L Scu预处理组。通过分析，结果发现细胞经Scu预处理后，Bcl-2/Bax比值显著（P<0.05）上调，且HSP70蛋白表达明显（P<0.05）升高，细胞损伤减轻。为揭示Scu保护LLC-PK1细胞耐热损伤的机制，利用RNAi技术抑制HSP70蛋白表达，然后我们将热应激LLC-PK1细胞随机分成5组：42℃热应激对照组（Ⅰ组）；42℃热应激转染试剂组（Ⅱ组）；42℃热应激10-6 mol/L Scu预处理组（Ⅲ组）；42℃热应激抑制HSP70表达组（Ⅳ组）；42℃热应激抑制HSP70表达，10-6mol/L Scu预处理组（Ⅴ组）。结果发现，Ⅲ组与Ⅴ组相比，胞浆cyt-c含量明显下降，pro-caspase-3表达升高；Ⅴ组与Ⅳ组相比，胞浆cyt-c含量明显下降，pro-caspase-3表达升高。本试验证实了Scu能够保护热应激造成的LLC-PK1细胞损伤，并且首次揭示了其机制与上调HSP70的表达有关。

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前言

1细胞凋亡

2 热休克蛋白70

3灯盏花乙素的研究进展

试验一 热应激对LLC-PK1细胞Bcl-2/Bax/pro-caspase-3/cyt-c表达的影响

1 试验材料

2试验方法

3 试验结果

4讨论

5 小结

试验二 不同浓度Scu对热应激条件下LLC-PK1细胞Bcl-2/Bax/pro-caspase-3/cyt-c/HSP70表达的影响

1 试验材料

2试验方法

3试验结果

4 讨论

5 小结

试验三RNA干扰LLC-PK1细胞HSP70基因有效序列筛选

1 试验材料

2试验方法

3试验结果

4 讨论

5 小结

试验四 Scu对热应激LLC-PK1细胞保护作用机制的研究

1 试验材料

2试验方法

3试验结果

4 讨论

5 小结

结论

参考文献

附 录A

附录B

导师组意见

致谢

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