Hsp90诱导表达对热应激损伤鸡心肌细胞的保护作用及其机理的研究

摘要

长时间、高强度的应激刺激会对机体重要组织器官（特别是心脏）造成严重病理损害。众多应激原可以影响畜禽生产和繁殖性能。热应激可以导致鸡生长速度降低、产蛋量下降，甚至导致鸡的突然性死亡，而这种死亡与应激诱导的心脏疾病密切相关。生物有机体在遭受应激刺激时会激发自身一种适应性防御性应激反应。在此过程中，机体细胞会在多种热休克因子(Heat shock factor，HSF)的调控下迅速合成一系列热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)而发挥保护作用。HSPs可以有效保护组织细胞免于各种应激性病理损伤和凋亡，其中，最为重要的热休克蛋白家族之一便是HSP90家族。Hsp90有助于其客户蛋白(Client protein)分子结构的成熟和稳定性保持，而这些客户蛋白多为细胞促生存/抗凋亡信号转导通路的关键蛋白。阿司匹林(ASA)可以降低机体对温度的敏感性阈值，从而更好地诱导机体发生应激保护性反应，如在热应激过程中诱导Hsp70的高表达。本文在成功建立体内、外鸡心肌细胞热应激模型的基础上动态研究了阿司匹林在热应激过程中对鸡心肌细胞Hsp90表达水平的影响及其抵抗细胞病理损伤/凋亡的作用，并从HSFs表达动力曲线和Hsp90相关信号转导通路两方面深入探讨了阿司匹林在上述过程中的调控与保护机制;同时，本文利用ASA和格尔德霉素(GA)分别作为Hsp90的诱导剂和抑制剂，在鸡原代心肌细胞水平上系统证明了Hsp90诱导表达对于鸡心肌细胞抵抗热应激损伤/凋亡的作用及其机制。
　　在建立鸡心肌细胞的体内、体外热应激模型基础上，于试验前2 h使用药物ASA（剂量分别为1 mg/kg体重和1 mg/mL）对试验鸡或者离体培养的心肌细胞分别进行饲喂或处理，以观察其对热应激处理后体内、体外心肌细胞热应激损伤的缓解作用。鸡心肌细胞体内热应激模型的建立选取饲养至21日龄的SPF鸡，体外培养的热应激鸡心肌细胞模型则采用鸡原代心肌细胞。试验组包括热应激组(HS)，阿司匹林+热应激组(ASA+HS)和阿司匹林组(ASA)，其中HS组和ASA+HS组试验鸡/鸡原代心肌细胞均于42℃条件下分别进行热应激处理，并分别于热应激处理至0h，1h，2h，3h，5h，7h，10h，15h和24 h时随机自各试验组中选取10只鸡或3个平皿的心肌细胞进行采样，采集的活体受试鸡的血清和培养皿中离体培养原代心肌细胞上清液直接送检，分别检测其中谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。而采取的鸡心肌组织和培养皿中的心肌细胞则分别用4％多聚甲醛固定。试验结果显示，热应激开始后，HS组受试鸡出现张口呼吸、呼吸频率增加、饮水量剧增和摄食量显著下降，受试鸡体温骤升至43℃。ASA+HS组受试鸡也表现拍打翅膀，饮水量增加和呼吸频率增加等症状;热应激后HS组受试鸡血清中AST、CK和LDH的活性水平显著增加。而ASA+HS组和ASA组受试鸡的相应酶则水平变化不大;组织病理学观察结果显示，热应激导致HS组受试鸡心肌细胞产生明显的以急性变性如颗粒变性和水泡变性为特征的变化，甚至出现心肌细胞核固缩、核碎裂，而ASA+HS组受试鸡心肌细胞则没有出现明显的核固缩、核碎裂等病理变化;体外培养的心肌细胞则显示，HS组心肌细胞培养上清中AST、CK和LDH水平显著升高，心肌细胞发生明显的颗粒变性和水泡变性，甚至出现核固缩、核碎裂等明显病理变化。而经过ASA处理的心肌细胞热应激损伤明显减轻，主要表现为细胞培养上清液中损伤相关酶的活性很多恢复至正常水平，心肌细胞也没有出现明显的细胞坏死特征。上述研究表明，ASA可以在体内、体外水平上显著减轻热应激对鸡心肌细胞的损伤及其程度。
　　通过给试验鸡提前2h饲喂ASA（1 mg/kg·bw），然后将受试鸡暴露于42℃环境下分别进行0，1，2，3，5，7，10，15和24 h的热应激处理，利用免疫组织化学和分子生物学检测方法，观察hsp90 mRNA，Hsp90和HSF在热应激过程中的变化规律，以探讨ASA是否通过Hsp90表达量的改变参与心肌细胞抗应激性病理损伤及其机理。试验结果显示，热应激过程中，鸡心肌细胞内HSF-1的诱导与消耗、HSF-2和HSF-3的下调导致了hsp90 mRNA转录启动的推迟。而ASA的饲喂不同程度地改变了HSF-1，2，3的表达水平，从而使鸡心肌细胞hsp90 mRNA在整个热应激过程中处于高表达状态，进而诱导了鸡心肌细胞Hsp90蛋白的提前高表达。同时，免疫组织化学检测结果显示，饲喂ASA可明显提高热应激过程中Hsp90在鸡心肌细胞核中以及心肌组织动脉、毛细血管内皮细胞中的滞留时间。说明ASA在机体内可通过调节鸡心肌细胞中HSFs的表达，进而诱导Hsp90的显著高表达及其在细胞核中的滞留，这与ASA有效提高鸡心肌细胞抗热应激损伤能力有显著关联。
　　利用RT-PCR，western blot，ELISA和TUNEL原位杂交技术等，分别对饲喂ASA后不同时间热应激处理的受试鸡的心脏组织中hsp90 mRNA转录水平、Hsp90蛋白表达、抗凋亡关键蛋白Akt表达与激活水平，以及心肌细胞凋亡率等方面进行动态观察。试验结果显示，暴露于热应激环境后，鸡心肌细胞中hsp90 mRNA转录和Hsp90蛋白表达均出现明显延迟，抑制了Akt的表达与激活，进而导致鸡心肌细胞内caspase-3与caspase-9活性和心肌细胞热应激凋亡率的显著升高。提前进行ASA饲喂处理后则可提前显著上调hsp90 mRNA的基因转录(P＜0.01)与其相应蛋白Hsp90的表达(2.3-4.1倍)。由此Akt的表达与激活水平也被相应提高，这有效抑制了心肌细胞内caspase-3与caspase-9的活性和心肌细胞的热应激凋亡率（降低2.14-2.56倍）。试验结果证实，提前进行ASA饲喂可以通过显著提前/提高鸡心肌细胞中Hsp90表达，诱导并激活抗凋亡信号通路关键蛋白Akt，进而有效抑制其热应激凋亡。
　　利用PCR，western blot，免疫细胞化学和细胞学检测技术，检测经ASA处理后体外培养鸡原代心肌细胞在热应激过程中应激性病理损伤、ASA处理对鸡原代心肌细胞hsp90 mRNA转录和Hsp90表达的诱导作用，探讨ASA诱导Hsp90表达、缓解鸡原代心肌细胞热应激损伤的保护作用及其机理。结果发现，用ASA(1 mg/mL)提前2h处理离体培养的心肌细胞，然后对体外培养心肌细胞进行热应激处理后，ASA在不影响鸡原代心肌细胞活性的条件下可显著诱导其Hsp90的高表达。而在42℃热应激处理过程中，ASA处理的鸡心肌细胞在热应激过程中出现了更强的Hsp90细胞质阳性信号，且Hsp90在细胞核内的滞留时间更为持久。相对于热应激组心肌细胞Hsp90在热应激过程中的4.1倍升高且快速下调，ASA处理的鸡心肌细胞Hsp90表达则是在高热应激前即出现显著升高（约11.1倍），并在热应激前期一直保持较高水平。同时，在整个试验过程中ASA处理的心肌细胞内hsp90 mRNA转录保持高表达，而热应激组心肌细胞内的hsp90 mRNA转录则一直低于应激前水平。结果表明，ASA处理可以显著诱导心肌细胞Hsp90的高表达，而且在热应激前用ASA诱导Hsp90提前高表达可使鸡原代心肌细胞在热应激过程中维持更高水平的Hsp90，特别是在细胞核中。
　　在系统评价ASA对鸡原代心肌细胞Hsp90的诱导表达和GA对其Hsp90的抑制表达基础上，分别用ASA和GA预处理鸡原代心肌细胞，然后进行热应激处理。结果发现，鸡原代心肌细胞的细胞活性、凋亡率和氧化应激水平在热应激初期即受到显著影响，且随着应激时间的延长，这种损伤程度越大;0.1μM及以上浓度的GA处理鸡原代心肌细胞可以有效抑制其Hsp90的表达水平。而ASA则可以显著(P＜0.05)提高心肌细胞热应激后的Hsp90表达，同时心肌细胞的活性更高、凋亡率和氧化应激水平更低;GA可以下调细胞热应激后的Hsp90表达(P＜0.05)，此时心肌细胞的活性更低、凋亡率和氧化应激水平更高;对于GA预处理的心肌细胞，与单独用GA处理的热应激心肌细胞相比，ASA处理则只能有限地提高热应激后心肌细胞Hsp90表达，这时心肌细胞的活性改善不明显、凋亡率和氧化应激水平均有一定程度的降低。研究结果说明，热应激过程中鸡原代心肌细胞活性、凋亡率和氧化应激水平均（即抗热应激损伤能力）与其Hsp90表达水平密切相关。
　　采用Hsp90诱导剂ASA和抑制剂GA预处理体外培养的鸡原代心肌细胞，然后进行5h的热应激处理后发现，与热应激组心肌细胞相比，ASA处理可有效上调热应激心肌细胞中Akt，STAT-3和p-IKKα/β的表达，Akt、STAT-3与Hsp90的共定位也相应提高，此时caspases酶的活性也相对较低;GA处理可显著抑制Akt表达和 p-IKKα/β水平，但可诱导STAT-3的高表达，同时Akt、STAT-3与Hsp90的共定位也明显降低，伴随着相对较高的caspases酶活性;GA预处理后，再用ASA处理鸡原代心肌细胞后，热应激处理心肌细胞内caspases酶活性被部分抑制，Akt表达水平及其与Hsp90的共定位一定程度上得到恢复，STAT-3与p-IKKα/β的表达被进一步下调，其与Hsp90的共定位也没有明显恢复。试验结果表明，不同Hsp90表达水平通过其对重要靶蛋白的调节，对鸡原代心肌细胞的抗应激性损伤和细胞凋亡具有关键的调控作用，而当Hsp90表达首先被抑制时，后续的Hsp90诱导剂处理则只能有限地提升心肌细胞的抗热应激能力。

目录

声明

论文说明

摘要

部分缩写的中英文对照

引言

第一章 热应激与热休克蛋白

1 热应激

1．1 应激概述

1．2 应激的生理调控

1．3 环境应激

1．4 热应激对细胞的损伤

1．5 热应激对机体的影响

2．1 热休克蛋白的概念

2．2 热休克蛋白的分类及特性

2．3 热休克蛋白的调控

2．4 热休克蛋白的作用

3 Hsp90的研究进展

3．1 Hsp90的基因与蛋白质结构

3．2 Hsp90的生物活性和靶蛋白

3．3 Hsp90与其靶蛋白的作用机制

3．4 Hsp90相关的主要信号转导通路

3．5 Hsp90与疾病治疗

4．1 阿司匹林的研究进展

4．2 格尔德霉素的研究进展

参考文献

第二章 阿司匹林对体内、体外热应激损伤鸡心肌细胞的药物保护作用研究

1．1 试验材料

1．2 试验设计

1．3 试验方法

2 结果

2．1 阿司匹林对热应激状态下受试鸡临床表现的影响

2．2 阿司匹林对热应激处理受试鸡血清心肌细胞损伤相关酶水平的影响

2．3 阿司匹林对热应激鸡心肌细胞的病理组织学变化的影响

2．4 阿司匹林对热应激离体培养鸡原代心肌细胞损伤程度的影响

2．5 阿司匹林对热应激鸡原代心肌细胞病理损伤的影响

3 讨论

参考文献

第三章 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞中Hsp90表达与定位的影响

1 材料和方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞中HSFs表达量的影响

2．2 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内hsp90 mRNA转录水平的影响

2．3 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Hsp90表达水平的影响

2．4 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞中Hsp90定位与分布的影响

2．5 阿司匹林对热应激处理鸡心脏血管内皮细胞中Hsp90定位与分布的影响

3 讨论

参考文献

第四章 阿司匹林诱导Hsp90表达对热应激处理鸡心肌细胞抗凋亡作用研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据分析

2 结果

2．1 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内hsp90 mRNA转录水平的影响

2．2 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Hsp90表达的影响

2．3 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内Akt表达及其激活的影响

2．4 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞内caspase-3，8，9活性水平的影响

2．5 阿司匹林对热应激处理鸡心肌细胞凋亡率的影响

3 讨论

参考文献

第五章 阿司匹林对热应激处理体外培养鸡原代心肌细胞Hsp90表达与定位的影响

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据分析

2 结果

2．1 阿司匹林对体外培养鸡原代心肌细胞Hsp90表达水平的诱导作用

2．2 阿司匹林对热应激处理体外培养鸡心肌细胞hsp90 mRNA转录的影响

2．3 阿司匹林对热应激处理体外培养鸡心肌细胞Hsp90表达的影响

2．4 阿司匹林对热应激处理体外培养鸡心肌细胞Hsp90定位与分布的影响

3 讨论

参考文献

第六章 Hsp90表达对体外培养鸡原代心肌细胞的抗热应激保护作用研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 统计分析

2 结果

2．1 热应激对鸡原代心肌细胞活性的影响

2．2 格尔德霉素对鸡原代心肌细胞Hsp90表达抑制作用的研究

2．3 阿司匹林和格尔德霉素对热应激处理鸡原代心肌细胞Hsp90表达的影响

2．4 Hsp90诱导表达对热应激状态下鸡原代心肌细胞活性、凋亡率及氧化应激水平的影响

3 讨论

参考文献

第七章 Hsp90诱导表达对热应激体外培养鸡原代心肌细胞抗凋亡机制研究

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．2 试验方法

1．3 数据分析

2 结果

2．1 Hsp90诱导表达对热应激处理鸡原代心肌细胞凋亡相关酶caspase-3，8，9活性的影响

2．2 Hsp90表达对热应激处理鸡原代心肌细胞Akt和STAT-3表达的影响

2．3 Hsp90表达对热应激处理鸡原代心抽细胞Akt、STAT-3与Hsp90共定位的影响

2．4 Hsp90表达对热应激状态下鸡原代心肌细胞p-IKKα／β表达水平的影响

3 讨论

参考文献

全文总结

创新点

主要试剂配制

硕博连读期间发表文章

致谢