杏鲍菇副产物免疫活性物质追踪与结构鉴定

摘要

本论文以工厂化杏鲍菇生产副产物为试验材料，分别利用不同有机溶剂粗提取、不同极性部位分段萃取、硅胶柱层析三个步骤对杏鲍菇副产物中的活性物质进行分离纯化，并对每一步中得到的提取物进行免疫活性研究，观察其对小鼠巨噬细胞的免疫刺激作用，以此对其中的免疫活性物质进行逐步筛选、活性追踪，并利用液相串联四级杆飞行时间质谱和核磁共振谱等波谱鉴定技术对主要活性成分进行结构表征，得到以下结论：
　　1.利用不同极性溶剂对杏鲍菇副产物中生物活性成分进行分段萃取，得到各提取物(石油醚提取物PEP、氯仿提取物PEC、乙酸乙酯提取物PEE、甲醇提取物PEM)，以小鼠巨噬细胞Ana-1为受试细胞，通过研究各极性提取物对Ana-1细胞存活率、细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌量的影响，结果表明：PEM、PEE对Ana-1细胞有不同程度上的免疫刺激作用，其中PEM表现出最强的促进细胞增殖和促进细胞因子分泌的活性，在PEM浓度为12.5μg/mL的条件下，促进Ana-1细胞增殖作用最强，细胞因子TNF-α和IL-6均出现分泌量高峰，但PEM对细胞因子分泌的作用时间不同，PEM作用于Ana-1细胞后，在12 h时出现TNF-α分泌高峰，而IL-6在24 h时出现分泌量高峰。
　　2.通过研究PEM对Ana-1细胞吞噬活性、细胞膜蛋白受体(TLR2、TLR4)表达量的影响，结果表明：在PEM浓度为25μg/mL的条件下，具有最强的Ana-1细胞吞噬活性促进作用，细胞膜蛋白受体TLR2出现表达量高峰，而细胞膜蛋白受体TLR4则在PEM浓度为50μg/mL的条件下出现表达量峰值。
　　3.对具有良好免疫活性作用的PEM进行不同极性溶剂分段萃取，得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水四个极性部位，通过研究各极性部位萃取物对Ana-1细胞存活率、细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌量和吞噬活性的影响，结果表明：正丁醇部位、乙酸乙酯部位、水部位对Ana-1细胞有不同程度上的免疫刺激作用，正丁醇部位表现出最强的促进细胞增殖和促进细胞因子分泌的活性，在正丁醇部位提取物浓度为25μg/mL的条件下，促进Ana-1细胞的增殖和吞噬活性作用最强，细胞因子TNF-α和IL-6均出现分泌高峰。采用GC-MS对正丁醇部位萃取物进行成分鉴定，结果显示正丁醇部位中主要含寡糖类、脂肪酸类、烷类、甾醇类、三萜类、核苷类等多种化合物。
　　4.通过硅胶柱层析对正丁醇部位萃取物进行分离，并利用薄层色谱检测其分离组分极性，合并极性相同组分后，得到7个洗脱组分(Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6、Fr.7)，通过研究各洗脱组分对Ana-1细胞存活率、细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌量的影响，结果表明：Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.6对Ana-1细胞有不同程度上的免疫刺激作用，其中Fr.2表现出最强的促进细胞增殖和促进细胞因子分泌的活性，在Fr.2浓度为12.5μg/mL的条件下，促进Ana-1细胞增殖作用最强，细胞因子TNF-α和IL-6均出现分泌高峰。
　　5.通过研究洗脱组分Fr.2对Ana-1细胞吞噬活性、细胞膜蛋白受体(TLR2、TLR4)表达量的影响，结果表明：在Fr.2浓度为12.5μg/mL的条件下，具有最强的Ana-1细胞吞噬活性促进作用，细胞膜蛋白受体TLR2出现表达量高峰，而细胞膜蛋白受体TLR4则在Fr.2浓度为25μg/mL的条件下出现表达量峰值。
　　6.通过液相串联四级杆飞行时间质谱(HPLC-QTOF-MS/MS)和核磁共振谱(1H、C13-NMR)对Fr.2中主要成分进行结构表征，并与推测目标物标准品的质谱、1H-NMR、C13-NMR等谱图进行对比，确定Fr.2中主要成分为腺苷，化学分子式为C10H13N5O4。