植物提取物对斜纹夜蛾酚氧化酶抑制作用研究

摘要

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）广泛存在于动物、植物、微生物等有机体内，是生物体内黑色素合成的关键酶。在昆虫的变态发育、免疫和防御系统中，酚氧化酶都起着重要的作用，因此可作为害虫控制的重要作用靶标。通过研究昆虫酚氧化酶的生物学特性，寻找有效的抑制剂，来筛选合成新型的、有效的生物农药已成为昆虫酚氧化酶研究中的热点。本文以斜纹夜蛾（Spodoptera litura Fabricius）幼虫的酚氧化酶为靶标，研究了酚氧化酶的酶学特性，5种植物不同溶剂提取物对酚氧化酶的体外抑制作用和臭椿水提取物、银杏乙醇提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性。
　　1.酚氧化酶的酶学特性
　　以邻苯二酚为底物，研究了斜纹夜蛾幼虫酚氧化酶的酶学特性。结果表明：斜纹夜蛾幼虫酚氧化酶的最适pH在6.7~7.0之间，pH6.8时，稳定性最好；最适温度为30℃，20~35℃之间，稳定性较好；在3 mL的测活体系中，当酶量为0.1 mL时，酶促反应速度随底物浓度升高而增大，当底物浓度为10 mmol/L时，酶促反应最快，超过10 mmol/L时，酶促反应趋于平衡；以邻苯二酚为底物时，斜纹夜蛾酚氧化酶的Km值为7.980 mmol/L，Vm为204.082?A/mg·10s。
　　2.植物平行提取物对酚氧化酶的抑制作用
　　采用酶标仪法测定了刚竹叶、银杏叶、接骨木叶、胡桃叶、臭椿叶和树皮提取物对斜纹夜蛾酚氧化酶活性的影响。结果表明：5种植物6种不同溶剂（极性大小：去离子水>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>氯仿>石油醚）获得的提取物在一定浓度范围内均对PO表现为抑制作用，且随提取物浓度的升高，抑制作用有逐渐增强的趋势，但抑制效果存在较大的差异：臭椿叶片的水提取物、接骨木叶片的三氯甲烷提取物、银杏叶片的乙醇提取物、刚竹叶片的丙酮提取物、和臭椿树皮的水提取物分别对PO的抑制效果最强，其IC50分别为：175、375、500、550和800 mg/L；抑制动力学研究表明刚竹、银杏、臭椿3种植物提取物对PO表现为可逆抑制效应，且刚竹提取物为非竞争性抑制类型，其抑制常数Ki为158.2 mg/L；而胡桃的提取物对PO的抑制作用较弱，且随提取物浓度的变化，抑制效果波动较大；接骨木提取物对PO表现为不可逆抑制效应。
　　3.植物顺序提取物对酚氧化酶的抑制作用
　　银杏叶片和臭椿叶片的顺序提取物对酚氧化酶的抑制效果均较平行提取物的抑制效果有所增强，银杏叶片和臭椿叶片乙醇提取物的抑制作用增强最明显，IC50分别为400 mg/L和375 mg/L，抑制作用分别提高了20％和37.5%。
　　4.银杏乙醇顺序提取物和臭椿水提取物的初纯化
　　对银杏叶片乙醇提取物和臭椿水提取物进一步分离纯化后，发现银杏叶萃取物中三氯甲烷萃取物对酚氧化酶的抑制效果最显著，随萃取物浓度的增加，抑制效果呈直线上升，当萃取物浓度为200 mg/L时，抑制效果为61.03%，比对照提高12.31%；臭椿水提取物中90%醇沉物对酚氧化酶的抑制效果最显著，当提取物浓度为200 mg/L时，抑制率为57.32%，比对照增加49.35%，说明臭椿提取物中对酚氧化酶具抑制作用的成分主要是多糖类。
　　5.银杏叶片乙醇提取物和臭椿叶片水提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性测定
　　采用叶碟法测定了银杏叶片乙醇提取物和臭椿叶片水提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性。结果表明：两种植物提取物对斜纹夜蛾幼虫均具有一定的胃毒和拒食作用，处理2 d后32 g/L银杏乙醇提取物和臭椿水提取物的拒食率分别为77.75%和89.30%，处理8 d后32 g/L提取物的校正死亡率分别为57.14%和43.14%。

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第一章 引言

1. 酚氧化酶研究综述

2. 斜纹夜蛾在园林植物上的发生概况

3. 以酚氧化酶为靶标，从植物中筛选合适抑制剂防治斜纹夜蛾的可行性分析

第二章 斜纹夜蛾酚氧化酶酶学特性研究

1. 材料与方法

2. 结果与分析

3. 讨论

本章小结

第三章 植物提取物对酚氧化酶的作用—平行提取法

第一节 刚竹叶片提取物对酚氧化酶活性的影响

第二节 银杏叶片平行提取物对酚氧化酶活性的影响

第三节 接骨木叶片平行提取物对酚氧化酶活性的影响

第四节 胡桃叶片提取物对酚氧化酶活性的影响

第五节 臭椿树皮、叶片提取物对酚氧化酶活性的影响

第六节 不同植物提取率与抑制效果比较

本章小结

第四章 植物提取物对酚氧化酶的作用—顺序提取法

第一节 银杏叶片提取物对酚氧化酶活性的影响

第二节 臭椿叶片顺序提取物对酚氧化酶活性的影响

本章小结

第五章 植物提取物的纯化

第一节 银杏乙醇提取物的纯化

第二节 臭椿去离子水提取物的纯化

本章小结

第六章 植物提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性

第一节 臭椿去离子水提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性

第二节 银杏乙醇提取物对斜纹夜蛾幼虫的生物活性

本章小结

总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文