植物次生代谢物质等三类化合物对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用及对试虫生长发育的影响

摘要

酚氧化酶（phenoloxidase，PO）（EC.1.14.18.1）对昆虫体壁形成过程中的硬化和黑化具有关键作用并具有重要的免疫功能，是发展环境友好害虫控制剂的潜在靶标。为筛选对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua（Hübner））酚氧化酶具有高抑制活性的化合物，寻找新型害虫控制剂的线索，本文采用酶标仪微量法测定了效应物对甜菜夜蛾5龄幼虫酚氧化酶的抑制活性并研究了高活性效应物的抑制动力学；采用摄食毒力法研究了3种效应物对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响。结果表明：
　　 1.以6种植物次生代谢物质桑黄素（morin）、甘醇酸（glycolic acid）、单宁酸（tannic acid）、甲基类虎皮楠素（methyl homosecodaphniphyllate）、熊果甙（arbutin）和脱氧杯花叶素B（deoxycalyciphylline B）为效应物，研究其对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用。结果表明：所试6种化合物对甜菜夜蛾酚氧化酶均有一定的抑制作用，抑制中浓度（IC50）分别为0.0557mmol·L-1、0.0561mmol·L-1、0.234 mmol·L-1、0.792mmol·L-1、1.633mmol·L-1和2.438mmol·L-1。研究了6种化合物对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制动力学，结果表明：熊果甙、甲基类虎皮楠素和脱氧杯花叶素B均为可逆竞争型抑制剂，桑黄素、甘醇酸和单宁酸均为典型的可逆非竞争型抑制剂；抑制常数（K1）分别为0.0381mmol·L-1、0.0441mmol·L-1、0.1938mmol·L-1、1.182mmol·L-1、1.269mmol·L-1和2.051mmol·L-1。单宁酸对靶标酚氧化酶的抑制作用与多巴氧化产物的还原有关；桑黄素、甘醇酸和熊果甙对靶标酚氧化酶的抑制作用与多巴氧化产物的还原无关；桑黄素直接对靶标酶作用，而不是通过影响酶结构内的铜离子来产生作用。
　　 2.以5种席夫碱化合物2-羟基-3-甲氧基苯甲醛缩3，4-二氯苯胺（2-hydroxy-3-methoxybenzylidene-3，4-dichloroaniline）、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩苯胺（2-hydroxy-4-methoxybenzylidene-aniline）、2-羟基-4-甲氧基苯甲醛缩间氯苯胺（2-hydroxy-4-methoxybenzylidene-3-chloroaniline）、水杨醛缩苯胺（salicylidene-aniline）、水杨醛缩间氯苯胺（salicylidene-3-chloroaniline）和3种苯甲酸衍生物4-溴苯甲酸（4-bromobenzoic acid）、4-氟苯甲酸（4-fluorobenzoic acid）、4-氯苯甲酸（4-chlorobenzoic acid）为效应物，研究了其对甜菜夜蛾酚氧化酶活力的影响，结果表明：所试8种化合物对甜菜夜蛾酚氧化酶均有一定的抑制活性，所试席夫碱化合物的抑制活性大于苯甲酸衍生物，8种化合物的抑制中浓度（IC50）分别为0.00715mmol·L-1、0.0337mmol·L-1、0.0473mmol·L-1、0.0204mmol·L-1、0.0852mmol·L-1、2.698mmol·L-1、3.852mmol·L-1和2.957mmol·L-1。以2-羟基-3-甲氧基苯甲醛缩3，4-二氯苯胺为代表进行动力学研究表明，该化合物对酚氧化酶的抑制作用表现为可逆竞争性抑制；抑制常数（K1）为0.0063mmol·L-1；其对靶标酚氧化酶的抑制作用与多巴氧化产物的还原无关。
　　 3.选用桑黄素、甘醇酸和单宁酸三种植物次生代谢物质，以摄食毒力法对甜菜夜蛾幼虫的生长发育进行了测定。结果表明，三化合物对甜菜夜蛾幼虫生长发育均具有明显影响，处理后7d，三化合物对试虫的致死毒力LC50分别为1.6981g·L-1、2.2282g·L-1和3.7723g·L-1；处理后11d，其LC50分别为1.2896g·L-1、0.2235g·L-1和1.0294g·L-1。此外，三化合物严重迟滞甜菜夜蛾低龄幼虫生长发育，而且桑黄素对3龄后幼虫亦表现明显抑制作用，可使处理组试虫体重增长抑制率高达79％以上；当桑黄素浓度高于2g·L-1时，处理试虫的化蛹率与羽化率均不到20％；高浓度的桑黄素与单宁酸对试虫的蛹重亦有明显影响。

目录

文摘

英文文摘

1 引言

2 材料与方法

2.1 供试药品、试剂及主要仪器

2.2 标准试虫及饲养

2.3 甜菜夜蛾酚氧化酶的初步纯化及其活性测定

2.4 效应物对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

2.4.1 效应物对酚氧化酶活力影响的测定

2.4.2 效应物对酚氧化酶的抑制效应的测定

2.4.3 效应物对酚氧化酶的抑制类型的测定

2.4.4 效应物对酚氧化酶的抑制常数的测定

2.4.5 效应物对酚氧化酶二酚酶反应进程的影响

2.4.6 金属铜离子和酶液对效应物紫外吸收光谱影响的测定

2.5 桑黄素、甘醇酸和单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响

2.5.1 试剂配置

2.5.2 摄食毒力测定

2.5.3 对甜菜夜蛾幼虫生长发育及蛹羽化的影响

3 结果与分析

3.1 抑制剂对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

3.1.1 植物次生代谢物质对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

3.1.2 席夫碱化合物和苯甲酸衍生物对甜菜夜蛾酚氧化酶的抑制作用

3.2 桑黄素、甘醇酸和单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响

3.2.1 桑黄素、甘醇酸和单宁酸对甜菜夜蛾幼虫的致死毒力

3.2.2 桑黄素、甘醇酸和单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育的影响

3.2.3 桑黄素、甘醇酸和单宁酸对甜菜夜蛾幼虫化蛹及蛹羽化的影响

4 讨论

4.1 甜菜夜蛾酚氧化酶纯化方法

4.2 甜菜夜蛾酚氧化酶活性测定方法

4.3 桑黄素等植物次生代谢物质对甜菜夜蛾酚氧化酶活力的影响及抑制动力学

4.4 桑黄素等化合物对甜菜夜蛾生长发育的影响

4.5 以PO为“靶标”设计新型害虫控制剂的思考

5 结论

6 参考文献

7 附录

8 致谢

9 攻读学位期间发表论文情况