重组人过氧化物酶体增殖物激活受体γ——胰高血糖素样肽-1的克隆、表达及纯化

摘要

背景:过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)属于核受体超家族中PPARs家族成员，为配体依赖性转录因子。PPARγ配体包括天然型配体和合成型配体，其中合成型配体噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZD)类药物可选择性的与PPARγ结合，TZD类药物能够增加骨骼肌中葡萄糖的利用，并降低体内肝脏的葡萄糖合成。有研究表明，PPARγ功能受损会导致严重的胰岛素抵抗。
　　 胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是胰岛α细胞和肠黏膜L细胞分泌的一种激素，含有30个氨基酸，经胰高糖素原加工，其N端形成胰高糖素，C端形成GLP-1和GLP-2。GLP-1的活性形式是GLP-1(7-36)，可以促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌、减少食物的摄取、减慢胃的排空、以及抑制胰高血糖素的分泌、刺激胰岛β细胞增殖，促进胰岛再生，又能抑制胰岛β细胞的凋亡。目前已有研究证明PPARγ和GLP-1在糖尿病治疗中的作用，然而有无既可恢复胰岛素敏感性又能促进胰岛β细胞增殖药物的研究，尚未见有关报道。
　　 目的:本实验构建含人过氧化物酶体增殖物激活受体γ-胰高血糖素样肽-1的原核表达载体(pET32a-PPARγ-GLP-1)，通过原核表达系统，获得大量融合蛋白，为进一步检测其生物活性提供研究基础。
　　 方法:从人脂肪中提取总RNA通过RT-PCR方法扩增出人PPARγ基因序列，从人外周血有核细胞中提取人类基因组DNA，PCR扩增获得GLP-1基因序列，通过基因重组技术构建pET32a-PPARγ-GLP-1，经双酶切及测序鉴定阳性克隆;转化入Rosseta(DE3)感受态细胞中，用IPTG诱导表达，表达产物经10％SDS-PAGE凝胶电泳，并做Western boltting鉴定。融合蛋白经镍离子层析纯化。
　　 结果:1.成功构建pET32a-PPARγ-GLP-1表达载体，经双酶切及测序鉴定。2.10％SDS-PAGE结果表明，目的基因在大肠杆菌Rosseta(DE3)中以包涵体形式表达，相对分子量(Mr)73kDa。3.经诱导表达条件优化，在37℃，诱导剂IPTG浓度为1mmol/L，诱导10h，可获得大量PPARγ-GLP-1融合蛋白。4.经Ni-NTA纯化获得较高浓度融合蛋白。5.Western blotting显示目的蛋白能被anti-his标签抗体识别，再次证实目的蛋白成功表达。
　　 结论:本研究证实可以成功构建pET32a-PPARγ-GLP-1重组质粒，且目的基因可在大肠杆菌Rosseta(DE3)原核表达系统中以包涵体形式高效表达。本研究初步建立了获得PPARγ-GLP-1融合蛋白的方法，为药物研发提供了良好的研究基础。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

材料与方法

1、实验材料

2、实验方法

结果

1 PPARγ基因的RT-PCR和GLP-1类似物基因的PCR结果

2 重组质粒的鉴定结果

3．表达产物的SDS-PAGE鉴定

4．融合蛋白的诱导表达

5 PPARγ-GLP-1的Ni-NTA纯化结果

6 PPARγ-GLP-1的Western blotting鉴定

讨论

1 pET32a-PPARγ-GLP-1表达载体的构建

2 PPARγ-GLP-1融合蛋白的表达及纯化

结论

参考文献

综述

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