重组人胰高血糖素样肽-1前药(Pro-rhGLP-1)的表达、纯化及药效学研究

摘要

研究背景：
　　糖尿病（Diabetes mellitus,DM）是严重威胁人类健康和生命的重大疾病，发病率和病死率逐年攀升，并呈年轻化趋势。患者中约95％为2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM），病情控制现状令人堪忧。目前治疗T2DM的药物仍以磺酰脲类、双胍类等口服降糖药为主，但该类药物最常见最危险的不良反应是引起持久性的低血糖，长期使用会因胰岛素过度分泌而导致胰岛β细胞功能衰竭。此外，由于T2DM的传统治疗侧重于缓解高血糖症状，而不是针对其真正发病原因，致使多数患者都无法逆转血糖控制能力的持续下降、β细胞数量的减少和功能的降低，因此研发疗效更好、使用安全，能够有效控制糖尿病多种症状及并发症的新型治疗药物，是当今新药研发领域的热点和重点。
　　研究目的：
　　胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1,GLP-1）是一种重要的肠道内分泌激素，具有降低过高血糖、促进胰岛素分泌、刺激胰岛β细胞增殖、抑制胰高血糖素分泌、降低胰岛素抵抗、延缓胃排空、抑制食欲、保护心血管和神经系统等作用，具备理想降糖药的多种特征，目前已成为糖尿病治疗药物研究领域倍受瞩目的研发热点。但由于天然的GLP-1在体内极易被DPPIV降解失活，限制了其临床应用，因此设法延长其作用时间是目前的攻关重点。本课题是在此基础上，采用前药设计思路，应用DNA重组技术将多个GLP-1活性分子通过连接肽融和，构建重组人胰高血糖素样肽-1前药（Prodrug of recombinant human GLP-1,Pro-rhGLP-1），并建立Pro-rhGLP-1的高效表达、纯化方法，观察Pro-rhGLP-1的体内外释药性能，并对其进行系统的药效学研究。
　　研究方法：
　　1.Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达、纯化和活性分析：采用融合标签技术，将合成的Pro-rhGLP-1基因克隆至大肠杆菌质粒载体pET32a(+)中，构建Trx·Tag和His·Tag与Pro-rhGLP-1的融合表达载体pET32a(+)-Pro-rhGLP-1；转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建表达菌株E.coliBL21(DE3)/pET32a(+)-Pro-rhGLP-1；IPTG诱导表达，12％SDS-PAGE检测蛋白表达量并进行可溶性分析；包涵体蛋白经洗涤溶解后透析复性；复性成功后采用Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLP-1标签融合蛋白；纯化后经肠激酶酶切去除融合标签；SDS-PAGE和HPLC分析蛋白纯度；Westernblot鉴定蛋白的特异性；OGTT检测Pro-rhGLP-1的体内生物学活性。
　　2.Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达、纯化和活性分析：采用PCR方法扩增Pro-rhGLP-1基因序列，克隆入去除标签的大肠杆菌质粒载体pET41a(+)中，同时采用Klenow片段补平酶切后5'末端的方法进行目的基因序列和pET41a(+)的平端连接，构建无标签表达载体pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)；转化大肠杆菌BL21(DE3)，0.01mMIPTG诱导目的蛋白表达；包涵体经梯度浓度尿素洗涤后溶解在8M尿素中，采用Q-SepharoseFF阴离子交换柱和Superdex75凝胶过滤柱对目的蛋白进行分离纯化；蛋白透析复性后去除内毒素并冷冻干燥；HPLC分析蛋白纯度；Westernblot鉴定蛋白特异性；OGTT检测目的蛋白的体内生物学活性；对冻干后的活性蛋白进行氨基酸组成分析、N末端氨基酸序列测定、C末端氨基酸序列测定、肽图分析、MALDI-TOF-MS分析等完成结构确证；完成目的蛋白的结构确证后，保留工程菌株E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)，并进行传代稳定性研究。
　　3.Pro-rhGLP-1的释药性能及药效学研究：建立Pro-rhGLP-1与人血浆的共孵育体系，在不同时间点取样，通过Westernblot对Pro-rhGLP-1的降解过程进行特异性分析，再通过ELISA，检测小鼠皮下注射Pro-rhGLP-1后的不同时间点血浆GLP-1水平，初步评价Pro-rhGLP-1的体内外释药过程；在离体分离的胰岛上观察Pro-rhGLP-1的体外促胰岛素分泌活性；在C57BL/6J和糖尿病db/db小鼠上观察单次和持续6周给药过程中，Pro-rhGLP-1对血糖水平、胰岛素分泌量、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性、摄食、体重、脂质含量及胰岛形态和功能的影响，对Pro-rhGLP-1进行系统的药效学评价。
　　实验结果：
　　1．Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达、纯化和活性分析：成功构建带有融合标签Trx·Tag和His·Tag的大肠杆菌表达载体pET32a(+)-Pro-rhGLP-1。0.01、0.1和1.0mMIPTG均能诱导Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达，融合蛋白分子量约35KD。融合表达产物主要以包涵体形式存在，表达量约为细菌总蛋白的50％。用不含尿素的0.02MPBS洗涤后，少量包涵体可以溶解，含8M尿素的PBS能够溶解约80％的包涵体蛋白。经Ni-NTA亲和层析分离纯化后，可得到纯度为95.43％的目的蛋白。C57BL/6J小鼠的OGTT结果表明，纯化后的Pro-rhGLP-1呈剂量依赖性降低血糖浓度，同时升高血浆胰岛素水平，等剂量Pro-rhGLP-1的降糖作用较GLP-1作用更强。
　　2．Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达、纯化和活性分析：成功构建大肠杆菌表达载体pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)。0.01、0.1和1.0mMIPTG均能诱导Pro-rhGLP-1的表达，分子量约19KD。表达产物主要以包涵体形式存在，表达量约占细菌总蛋白60％以上，降低诱导温度和降低IPTG浓度均未能实现目的蛋白的可溶性表达。用多种不含尿素的缓冲液在不同pH值时洗涤包涵体，效果均不佳，换用梯度浓度尿素对包涵体进行洗涤，8M尿素可以溶解90％以上的包涵体。溶解后的包涵体经离子交换和凝胶过滤层析分离纯化后，纯度达97.55％。透析复性后测定生物学活性，结果表明，Pro-rhGLP-1在体内具有生物学活性，可以降低血糖，升高血清胰岛素水平，且降糖作用较GLP-1更强。结构确证结果与预期一致。工程菌E.coliBL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)连续传至50代，质粒未丢失，表达量稳定，表达产物正确。
　　3．Pro-rhGLP-1的释药性能及药效学研究：(1)与血浆共孵育15min后，即可检测到来自Pro-rhGLP-1的GLP-1，GLP-1释放量随时间延长增加，孵育12h后，约80％的产物为GLP-1；(2)C57BL/6J小鼠单次皮下注射Pro-rhGLP-1后12h，血浆中仍可检测到高于基础水平的GLP-1；(3)在无血清培养的离体胰岛上，Pro-rhGLP-1不能促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌，而对照组GLP-1却可以显著刺激胰岛素分泌，并表现出良好的量效关系；(4)Pro-rhGLP-1(3nmol/kg)降糖作用明显，糖尿病db/db小鼠单次皮下给药后的降糖作用可维持至少12h。6周治疗过程中，db/db小鼠空腹血糖和HbA1c水平均显著降低，且在停药6周后仍维持在较低水平；(5)Pro-rhGLP-1(3nmol/kg)可以显著促进胰岛素分泌，IGI较对照组增加8.2倍；(6)Pro-rhGLP-1可显著抑制摄食，中剂量(3nmol/kg)给药后C57BL/6J小鼠的24h摄食量减少了51±11％；给药6周期间，糖尿病db/db小鼠的摄食量较对照组减少了约32％；(7)Pro-rhGLP-1在有效减轻糖尿病小鼠体重的同时，也显著降低了体脂含量及血浆中的瘦素、甘油三酯和游离脂肪酸水平；(8)经Pro-rhGLP-1治疗6周后，db/db小鼠的HOMA-IR下降，QUICKI升高；(9)胰岛形态学分析结果表明，Pro-rhGLP-1治疗6周后，db/db小鼠胰岛面积增大，数量增多，还可刺激胰岛β细胞增殖。
　　结论：
　　1．我们首次采用前药设计思路构建了GLP-1前体药物Pro-rhGLP-1，在大肠杆菌原核表达系统中，建立了Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达和纯化方法，获得了纯度大于95％的目标蛋白，为Pro-rhGLP-1作为药用蛋白的获得提供了简便易行的方法。
　　2．体外无药理活性的Pro-rhGLP-1进入体内后可以缓慢降解，释放出多个GLP-1活性分子，释放时间长达12h以上。
　　3．在离体培养的胰岛上，Pro-rhGLP-1没有促胰岛素分泌效应。但在动物实验中，呈剂量依赖性的增加胰岛素分泌量并降低血糖，且不降低正常血糖；降糖作用较GLP-1强而持久，一次给药后可维持12h以上；同时，Pro-rhGLP-1还能够提高葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性，促进胰岛β细胞增殖，降低体脂含量和甘油三酯水平，抑制摄食并减轻体重。
　　4．Pro-rhGLP-1具有理想的降低血糖、保护胰岛功能、提高胰岛素敏感性及改善糖和脂质代谢障碍的作用，功效更全面，疗效强而持久，对2型糖尿病及相关肥胖具有显著治疗优势。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

(一) GLP-1 的研究进展

(二) GLP-1 相关药物的国外研发现状

(三) GLP-1 相关药物的国内研发现状

实验部分

第一部分 人胰高血糖素样肽-1 前药标签融合蛋白的表达、纯化及活性测定

1 材 料

2 方 法

3 结 果

4 讨 论

第二部分 人胰高血糖素样肽-1 前药无标签重组蛋白的表达、纯化及活性测定

1 材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

第三部分 人胰高血糖素样肽-1 前药的释药性能及药效学研究

1 材料

2 方法

3 结 果

4 讨 论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢