载脂蛋白apoE修饰脂质体定向介导HSVtK自杀基因在肝癌细胞中的表达研究

摘要

目的：将载脂蛋白apoE和普通脂质体lipoplexes偶联，构建一种具有肝细胞和肝癌细胞靶向性的基因治疗载体apoE-lipoplexes;使用pGenesil-1质粒，以EGFP基因作为报告基因，检测基因运载体apoE-lipoplexes对肝细胞以及肝癌细胞的转染效率;构建pAFP-TK-IRES2-EGFP自杀基因载体质粒;检测甲胎蛋白(AFP)启动子调控胸苷激酶(HSVtK)自杀基因在肝癌细胞中特异表达水平;评价HSVtK自杀基因对肝癌细胞的杀伤效果。 方法：制备普通阳离子脂质体(lipoplexes)和阳离子脂质体载脂蛋白复合物（apoE-lipoplexes）;分别使用apoE-lipoplexes和lipoplexes两种脂质体，将携带EGFP标记基因的pGenesil-1质粒转染HL-7702肝细胞、HUH-7肝癌细胞和HepG2肝癌细胞，使用流式细胞仪检测两种载体对细胞的转染效率;构建pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒;使用脂质体携带pAFP-TK-IRES2-EGFP真核细胞表达质粒转染上述三种细胞;通过Western-blot方法检测HSVtK自杀基因在肝癌细胞和肝细胞中的表达水平;使用G418筛选获得稳定转染HSVtK自杀基因的HepG2肝癌细胞株，添加不同剂量的更昔洛韦(GCV)，用CCK-8试剂检测HSVtK基因对HepG2肝癌细胞的杀伤效果。 结果：与对照组lipoplexes比较，实验组apoE-lipoplexes对肝细胞和肝癌细胞的转染效率显著提高(P＜0.05);成功构建pAFP-TK-IRES2-EGFP自杀基因载体质粒;在AFP启动子调控下，HSVtK自杀基因在AFP阳性的HepG2、HUH-7肝癌细胞中表达水平较高，而在AFP阴性的HL-7702肝细胞中表达量很低(P＜0.05)。使用G418试剂成功筛选、获得稳定转染HSVtK基因的HepG2肝癌细胞株(HepG2-kK);随着GCV剂量增加，HSVtK自杀基因对HepG2-TK肝癌细胞的杀伤作用逐渐增强(P＜0.05)。 结论：实验成功构建了一种对肝细胞和肝癌细胞具有较高转染效率的非病毒基因治疗载体apoE-lipoplexes;实验验证了在AFP启动子调控下， HSVtK自杀基因在甲胎蛋白阳性的肝癌细胞中成功表达;验证了不同浓度的GCV对稳定转染HSVtK自杀基因的HepG2肝癌细胞杀伤效果，为肝癌靶向基因治疗提供了实验依据。

目录

声明

摘要

前言

第一章 实验材料

1．细胞株

2．菌株

3．质粒

4．主要试剂

5．主要实验器材

6 试剂的配制

第二章 实验方法

1 细胞培养、传代、计数、冻存、复苏

2 pAFP-TK-IRES2-EGFP质粒的构建、转化、提取、酶切鉴定

3 载脂蛋白apoE修饰脂质体的构建

4 载体包裹质粒实验

5 细胞转染

6 转染效率测定

7 受转染细胞TK蛋白表达情况

8 G418筛选稳定转染HSV-TK基因肝癌细胞株

9 CCK-8试剂检测不同浓度GCV对稳定转染HSV-TK基因肝癌细胞株的杀伤效果

10 统计学分析

第三章 实验结果

1 细胞培养

2 质粒酶切鉴定

3 apoE修饰脂质体构建

4 载体包裹质粒DNA实验

5 apoE-lipoplexes与lipoplexes转染率测定

6 TK蛋白表达

7 G418筛选稳定转染HSV-TK基因的HepG2肝癌细胞株

8 GCV对稳定转染HSVtK基因肝癌细胞株的杀伤效果

第四章 讨论

参考文献

综述 肝癌的基因治疗

附录

攻读学位期间发表文章情况

致谢

个人简历