自噬调控对JAK2 V617F阳性HEL细胞及真性红细胞增多症患者造血细胞增殖的影响

摘要

目的:
　　通过检测JAK2 V617F阳性HEL细胞及真性红细胞增多症（PV）患者造血细胞自噬水平，探索自噬调控对HEL细胞及PV患者造血细胞增殖的影响。
　　方法:
　　1.检测JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬活性：应用流式细胞术及吖啶橙（AO）染色法检测HEL细胞内LC3-蛋白的表达，以JAK2 V617F阴性K562细胞为对照；
　　2.诱导或抑制JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬后检测细胞内LC3-Π蛋白的表达：自噬诱导剂雷帕霉素（终浓度为10μmol/L）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（终浓度10mmol/L）分别作用于HEL细胞48h后，流式细胞术和吖啶橙（AO）染色法检测HEL细胞内LC3-Π蛋白的表达。
　　3.诱导或抑制JAK2 V617F阳性HEL细胞自噬活性后CellTiter-Glo○R发光法检测细胞增殖活力：自噬诱导剂雷帕霉素（终浓度为10μmol/L）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（终浓度10mmol/L）分别作用于HEL细胞0h、12h、24h、48h后，CellTiter-Glo○R发光法检测细胞增殖活力。
　　4.检测JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞自噬活性：采集12例临床上确诊的JAK2 V617F阳性PV患者外周血，以15例健康体检者外周血为对照，流式细胞术和Western blot法检测JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达。
　　5.诱导或抑制自噬后检测JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达：自噬诱导剂雷帕霉素（终浓度为10μmol/L）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（终浓度10mmol/L）分别作用于JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞48h后，流式细胞术和Western blot法检测细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达。
　　6.诱导或抑制JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞自噬活性后CellTiter-Glo○R发光法检测细胞增殖活力：自噬诱导剂雷帕霉素（终浓度为10μmol/L）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（终浓度10mmol/L）分别作用于JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞0h、12h、24h、48h后，CellTiter-Glo○R发光法检测细胞增殖活力。
　　结果:
　　1.LC3-Ⅱ蛋白在HEL细胞内的表达水平流式细胞术检测HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白的平均荧光强度值明显高于 JAK2 V617F阴性 K562细胞，分别为（159388.67±29001.10）、（96046.67±24134.08）（P﹤0.05）；AO染色荧光显微镜观察HEL细胞内自噬体形成明显高于K562细胞。
　　2.自噬活性改变后JAK2 V617F阳性HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达流式细胞术检测结果显示对照组、雷帕霉素处理组、3-甲基腺嘌呤处理组三组细胞内LC3-II蛋白的平均荧光强度值分别为（95533.33±4273.56）、（268333.30±33560.89）、（20000.00±7285.60）（P﹤0.05）。
　　3.自噬活性改变对JAK2 V617F阳性HEL细胞增殖活力的影响 HEL细胞常规培养，于12h、24h、48h各时间点检测细胞活力，细胞呈增殖状态；自噬诱导剂雷帕霉素作用于HEL细胞12h、24h、48h后，各时间点检测细胞增殖活力较对照组对应各时间点明显增强（P﹤0.05）；而自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤作用于HEL细胞，于12h、24h、48h各时间点观察细胞增殖活力较对照组对应各时间点明显降低（P﹤0.05），48h时雷帕霉素处理组（101413.00±3720.54）、3-MA处理组（5732.00±165.64）细胞增殖活力与对照组（29435.33±971.84）比较差异有统计学意义（P﹤0.05）。
　　4.JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白的表达流式细胞术检测12例PV患者外周血中髓系细胞内LC3-Ⅱ蛋白平均荧光强度值明显高于15例健康体检者外周血髓系细胞，分别为（92841.67±4249.59）、（86633.33±2503.90）（P﹤0.05）；Western blot检测3例PV患者外周血细胞内LC3-II蛋白表达高于健康体检者。
　　5.诱导或抑制自噬对JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达的影响流式细胞术检测结果显示，对照组、雷帕霉素处理组、3-甲基腺嘌呤处理组三组髓系细胞内 LC3-Ⅱ蛋白平均荧光强度值分别为（75433.33±10920.78）、（98000.00±2475.88）、（48733.33±6978.78），三组差异均有统计学意义（P﹤0.05）；Western blot检测结果显示，3-MA处理组骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较对照组明显降低；雷帕霉素处理组骨髓细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较对照组升高。
　　6.自噬活性改变对JAK2 V617F阳性PV患者骨髓细胞增殖活力的影响 PV患者骨髓细胞常规培养，随培养时间延长呈增殖趋势，应用雷帕霉素和3-MA分别诱导和抑制自噬，于0h、12h、24h、48h各时间点观察细胞增殖活力，结果显示，雷帕霉素和3-MA对PV患者骨髓细胞分别有促进和抑制细胞增殖的作用,与对照组对应各时间点比较，差异均有统计学意义（P﹤0.05），48h时对照组、雷帕霉素处理组、3-MA处理组细胞增殖活力分别为（16200.33±680.00）、（18743.67±1015.09）、（5371.00±55.87），差异有统计学意义（P﹤0.05）。
　　结论:
　　1.JAK2 V617F阳性HEL细胞和PV患者造血细胞存在较高的基础自噬水平：JAK2 V617F阳性HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达较JAK2 V617F阴性K562细胞明显增加；JAK2 V617F阳性PV患者外周血细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达表达明显高于健康体检者外周血细胞。
　　2.上调自噬活性可促进JAK2 V617F阳性HEL细胞和PV患者骨髓细胞的增殖；下调自噬活性对JAK2 V617F阳性 HEL细胞和PV患者骨髓细胞的增殖有明显抑制作用。
　　3.自噬异常是真性红细胞增多症发生发展的病理生理学机制之一，自噬调控可能是PV治疗的新靶点。

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常用缩写词中英文对照表

前言

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法

2 结 果

2.1 JAK2 V617F+HEL细胞自噬活性的检测

2.2 自噬调控对JAK2 V617F+HEL细胞内LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

2.3 JAK2 V617F+PV患者造血细胞自噬活性的检测

2.4 自噬调控对JAK2 V617F+PV患者骨髓细胞内LC3-Ⅱ表达的影响

2.5 自噬活性改变对JAK2 V617F+HEL细胞增殖活力的影响

2.6 自噬活性改变对JAK2 V617F+PV患者骨髓细胞增殖活力的影响

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述

综述一： 自噬与血液肿瘤关系研究进展

综述二： CALR基因突变与JAK2/MPL突变阴性的骨髓增殖性肿瘤的关系

致谢

在学期间承担/参与的科研课题与研究成果

个人简历