重组人促红细胞生成素抑制自噬减轻心肌微血管内皮细胞氧化应激损伤

摘要

目的：
　　通过建立过氧化氢（H2O2）诱导的氧化应激损伤模型，观察不同浓度范围的重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin,rhEPO)对心肌微血管内皮细胞氧化应激损伤的保护作用，并初步探讨rhEPO的保护作用对自噬的影响和可能的机制。
　　方法：
　　1.选取健康的SD雄性大鼠心脏的左心室心肌，利用改良组织块贴壁法获得心肌微血管内皮细胞（cardica microvascular endothelial cells, CMECs）；通过倒置显微镜对细胞进行形态学观察，采用vWF因子相关抗原免疫荧光法对细胞进行鉴定。2.采用H2O2构建心肌微血管内皮细胞氧化应激损伤模型，利用MTT比色法测定细胞存活率，确定H2O2处理细胞造成氧化应激损伤的适宜时间和浓度。3.用不同浓度（5、10、20、40U/ml）rhEPO和200umol/l H2O孵育心肌微血管内皮细胞，用MTT比色法测定细胞存活率，并用化学比色法测定不同rhEPO浓度下心肌微血管内皮细胞上清液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）含量，确定rhEPO有效浓度范围。4.用Western-blot方法检测各组细胞LC3Ⅱ和Beclin1的蛋白表达量，观察有效浓度范围的重组人促红细胞生成素（rhEPO）对氧化应激模型中的心肌微血管内皮细胞自噬水平的影响。5.用Western-blot方法检测各组细胞p-mTOR的表达量，观察不同浓度rhEPO对p-mTOR诱导表达的影响。
　　结果：
　　1.原代培养CMECs一周后，细胞形态多呈梭形和多角形等不规则形，形成单层紧密排列时呈鹅卵石样结构；免疫荧光检测FITC标记vWF相关抗体阳性率90％以上；2.与正常对照组相比，当H2O2浓度为200umol/l，作用时间为2小时，细胞生存状态差，心肌微血管内皮细胞存活率显著降低（p<0.05）。因此本实验选用200umol/l H2O2，处理2小时，为建模浓度和时间。3.与正常对照组相比，200umol/l H2O2处理的各组细胞，存活率降低(P<0.05)，LDH释放量增加（P<0.05）；不同浓度rhEPO预处理的细胞，与单纯 H2O2组相比，上述指标可明显逆转（P<0.05），但40U/mlrhEPO和20U/mlrhEPO相比，逆转不明显（P>0.05）。4.与正常对照组相比，单纯H2O2处理组LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达水平明显增高（P<0.05）；不同浓度的rhEPO预处理后，LC3Ⅱ和Beclin1蛋白表达量可明显减低，与单纯H2O2组相比均具有显著差异（P<0.05）。5.与正常对照组相比，单纯 H2O2组p-mTOR的表达降低（P<0.05）;不同浓度的rhEPO预处理后，均能诱导心肌微血管内皮细胞p-mTOR的表达增高，与单纯H2O2组相比有显著差异（P<0.05）,且存在浓度依存性。
　　结论：
　　1.H2O2可以诱导心肌微血管内皮细胞氧化损伤并引起细胞过度自噬；2.一定浓度范围内rhEPO对H2O2诱导的心肌微血管内皮细胞氧化应激损伤有保护作用，这种保护作用可能是与rhEPO激活PI3K/AKT/mTOR通路，抑制过氧化氢诱导心肌微血管内皮细胞过度自噬有关。