MPLA 497-L498ins4一个新突变基因对BaF3细胞增殖的作用研究

摘要

目的：
　　骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类以一系或多系髓系细胞包括红系、粒系和巨核系增殖为主要特征的克隆性造血干细胞疾病。其中经典的三类MPN疾病包括真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF），其临床表现较为相似且可以相互转化。目前发现JAK2 V617F、JAK2 exon12、MPL exon10以及CALR exon9为MPN中PV、ET、PMF三种疾病的主要分子病因。我们前期通过对771例确诊的MPN病人进行上述基因筛查时发现其中2例患者同时存在MPL基因的一种新突变类型（命名为MPL A497-L498ins4）。MPL基因编码血小板生成素受体（TPOR）蛋白分子，TPOR的近跨膜区aa514-518无配体结合时可阻止受体二聚体相互靠近，进而激活其下游如JAK2-STAT信号通路引起细胞增殖。以往研究报道的MPL基因突变类型主要为MPL W515点突变，并曾证实该突变可导致细胞产生自主促增殖能力，其机制可能是由于该突变引起TPOR的aa514-518区域结构异常进而导致细胞自主促增殖活性。MPL A497-L498ins4为插入4个氨基酸的突变，但并不在TPOR的aa514-518区域，那么该突变是否为引起患者MPN发生的驱动基因呢？为此本课题组拟通过慢病毒基因转导技术将该基因突变以及对照基因转导小鼠原B淋巴细胞（BaF3）中，从细胞学水平探讨该突变具有自主促细胞的作用。
　　方法：
　　1.构建MPL A497-L498ins4及对照基因的慢病毒表达载体
　　用RT-PCR法获取MPL A497-L498ins4及对照基因MPL W515L、MPL WT的CDS区全长，将PCR产物及慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV（简写为MSCV）通过双酶切、酶切产物回收、连接反应将上述目的基因插入到慢病毒表达载体中，并分别命名为MPL A497-L498ins4-MSCV（目的）、MPL W515L-MSCV（阳性对照）、MPL WT-MSCV（野生型对照）重组质粒，测序鉴定。
　　2.建立可稳定表达MPL A497-L498ins4及各对照基因的BaF3细胞株
　　采用脂质体转染法将各目的基因及包装质粒转导至293T包装细胞中，获得慢病毒颗粒后按最适比例感染BaF3细胞，用流式细胞仪分选GFP阳性细胞，对分选后的细胞扩大培养，获得可稳定表达目的基因及各对照基因的BaF3细胞株。
　　3.比较分析MPL A497-L498ins4在无IL-3培养条件下对BaF3细胞的增殖作用
　　正常情况下，BaF3细胞需要依赖鼠IL-3因子才能维持正常生长。突变型MPL可使BaF3细胞不依赖IL-3自主增殖。因此本研究通过IL-3撤退实验观察MPL A497-L498ins4对BaF3细胞增殖的影响，以此证实该突变体是否具有自主促细胞增殖的作用。设立MPL W515L-BaF3细胞、MPL WT-BaF3细胞、MSCV-BaF3细胞及BaF3细胞分别作为本实验的阳性对照、野生型对照、载体对照及空白对照，所有各组均加无IL-3培养基进行培养，收集0h、24h、48h、72h各时间点各组细胞，采用CCK-8法测定各实验组中BaF3细胞增殖情况并进行统计分析。
　　4.比较分析MPL A497-L498ins4对其配体TPO的敏感性
　　MPL基因编码血小板生成素受体（TPOR），其配体为TPO。MPL基因突变可致TPOR不依赖配体TPO自主结构性活化，因此突变型MPL在缺乏或低浓度TPO的情况下依然可引起细胞自我增殖，而野生型MPL则必须依赖一定浓度的TPO刺激才能引起细胞增殖。因此本研究可通过检测TPO敏感性实验再次证实MPL A497-L498ins4突变是否具有自主促细胞增殖活性。分组同上，设立6个TPO不同浓度梯度（2ng/ml、1ng/ml、0.1ng/ml、0.01ng/m、0.001ng/ml、0ng/ml）培养96h，采用CCK-8法测定各实验组中BaF3细胞增殖情况并进行统计分析。
　　结果：
　　1.各基因慢病毒表达载体的构建与鉴定
　　各基因MPL A497-L498ins4、MPL W515L、MPL WT成功连接到慢病毒表达载体pCDH-MCS-T2A-copGFP-MSCV中，经一代测序法分别对插入载体的各基因进行序列鉴定，Blast分析结果显示各组载体插入基因序列均正确。
　　2.各基因慢病毒转导BaF3细胞模型的建立与鉴定
　　利用已构建的表达载体，制备MPL A497-L498ins4及对照（阳性对照MPL W515L、野生型MPL WT、空载体MSCV）各基因慢病毒悬液并感染BaF3细胞株，流式检测各组感染率依次为：82％、77%、70.5%、95.7%。应用流式分选仪对小于90%GFP阳性率的细胞进行分选，最终使各组GFP阳性率均呈90%以上。应用RT-PCR方法及CD110-PE流式检测方法分别鉴定各组细胞转导基因的mRNA与蛋白表达情况：结果显示除空载体MSCV组外其它各组均有目的基因表达，且各蛋白分子均定位于BaF3细胞膜上。所有结果提示成功建立稳定表达各基因的BaF3细胞模型。
　　3. MPL A497-L498ins4在无IL-3培养条件下对BaF3细胞的增殖能力分析
　　应用CCK-8检测不同时间点各组BaF3细胞不依赖IL-3生长情况，结果显示：MPL WT组、MSCV组及BaF3组在各时间点细胞增殖无显著变化，且各组之间无统计学差异（P>0.05）。MPL A497-L498ins4组与MPL W515L组在48h、72h细胞均出现明显增殖，与MPL WT、MSCV、BaF3三组相比，均有统计学差异（P<0.01），但MPL A497-L498ins4组与MPL W515L组细胞增殖情况无统计学差异（P>0.05）。4. MPL A497-L498ins4突变对其配体TPO敏感性分析
　　应用CCK-8检测各组BaF3细胞在TPO不同浓度下的增殖情况，结果显示：在2ng/ml及1ng/ml TPO浓度时，MPL A497-L498ins4、MPL W515L、MPL WT三组细胞均有明显增殖，与MSCV、BaF3两组比较有统计学差异（P<0.01）；在其余TPO浓度时，MPL WT、MSCV、BaF3三组无明显增殖，而MPL A497-L498ins4、MPL W515L组细胞增殖较为显著，且与其余三组相比，均有统计学差异（P<0.01）。
　　结论：
　　MPL A497-L498ins4突变体可致BaF3细胞不依赖IL-3生长，同时该突变体对低浓度TPO较野生型MPL敏感，提示该突变体具有与MPL W515L突变体同样的自主促细胞增殖活性。

目录

声明

常用缩写词中英文对照表

前言

1. 材料与方法

1.1材料

1.2 方法

1.3统计学分析

2 结果

2.1 慢病毒表达载体的构建及测序鉴定

2.2 MPL A497-L498ins4-MSCV、MPL W515L-MSCV、MPL WT-MSCV、MSCV慢病毒包装

2.3 MPLA497-L498ins4基因对BaF3细胞的影响

3 讨 论

4 结 论

参考文献

综述:表观遗传分子异常在骨髓增殖性肿瘤中的研究进展

致谢

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