苦荞过敏原TBa的定点突变及免疫活性研究

摘要

荞麦作为一种健康保健食品，种子中含有丰富的蛋白，氨基酸，芸香苷和黄酮醇，具有抗高血压和血管出血的功效。由于它通常可使部分接触或食用的人发生严重的过敏反应，并且临床症状多样，这就极大的限制了其作为一种新型保健食品和食品添加剂的使用范围。荞麦过敏原蛋白分子和其过敏机制的研究对于荞麦过敏症的精确诊断和安全治疗至关重要且刻不容缓。
　　我们先前的工作分离纯化得到云南苦荞中一种分子量大小为24kDa的过敏蛋白(TBa)，经过各种免疫活性检测发现它是荞麦中的一种主要过敏原。通过分子克隆，首次得到了TBa的核苷酸序列，并在GenBank进行了登陆(登录号:AY044918)。本研究通过抗原表位软件预测，将TBa全长氨基酸序列划分为六个表位区段:E1:27-67，E2:87-137，E12:27-137，E3:120-156，E6:155-191，E36:120-191。经检测，E1与荞麦过敏症患者血清结合能力最强，说明E1可能是其中的主要表位。
　　在NCBI网站上用BLAST软件对TBa和其他一些已知蛋白质的氨基酸序列进行分析发现，TBa中20-160位（主要表位E1的第27-67位）氨基酸区域属于cupin超家族，此区域是这一家族的特征序列。在此基础上，使用DNAStar软件将E1的序列和同源性较高的其他植物种子贮藏蛋白进行比对，结果显示39，42，47和54的亮氨酸高度保守，并且二级结构预测也表明这几个位点的氨基酸处于柔性较好的区域。
　　进一步将E1进行定点突变，用精氨酸取代39，42，47，54的亮氨酸和52位的缬氨酸，并分别命名为L39R，L42R，L47R，V52R和L54R。将突变体基因与表达载体pET-32m连接，转化入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。Ni2+-NTA亲和纯化后，SDS-PAGE检测表明突变体的分子量与E1一致，纯度达到95％以上。采用ELISA和点杂交的方法检测重组蛋白与过敏症患者及健康者血清的IgE结合活性。结果表明五个突变体的免疫活性都有所降低，其中L42R，L47R和L54R的活性降低了约50％。说明TBa分子中的42，47，54位的亮氨酸对其致过敏性起着重要作用，本文不仅确定了TBa过敏原分子中的关键氨基酸，而且也为探讨荞麦过敏原的致敏机理及应用研究奠定了研究基础。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 过敏原概述

1．1 过敏原的定义

1．2 过敏原的临床免疫特征

1．3 主要过敏原的特征

1．4 过敏性的决定因素

1．5 交叉反应

1．6 线性表位和构象表位

2 过敏原的分类

2．1 按照来源分类

2．2 按照结构和序列同源性分类

3 荞麦过敏研究进展

4 本研究的目的和意义

第二章 苦荞过敏原TBa的定点突变

1 材料

1．1 菌种及质粒

1．2 试剂及工具酶

1．3 寡聚核苷酸引物

2 方法

2．1 过敏原TBa结构保守区域分析

2．2 TBa序列的同源性比对

2．3 TBa蛋白质的二级结构分析

2．4 E1表位区段的定点突变

2．5 突变体重组表达载体的构建

3 结果

3．1 过敏原TBa结构保守区域分析

3．2 TBa序列的同源性比对及二级结构预测

3．3 El表位区段的定点突变

3．4 突变体重组表达载体的构建

4 讨论

第三章 TBa突变体蛋白的表达，纯化及鉴定

1 材料

1．1 菌株及载体

1．2 试剂及工具酶

2 方法

2．1 重组质粒的诱导表达

2．2 Ni2+-NTA亲和层析

2．3 蛋白质浓度的测定

2．4 Western blot检测

3 结果

3．1 重组质粒的诱导表达

3．2 目的蛋白的电泳分析

3．3 蛋白质浓度的测定

3．4 表达产物的Western blot鉴定

4 讨论

第四章 TBa突变体蛋白的免疫活性鉴定

1 材料

1．1 实验仪器和设备

1．2 实验试剂

2 方法

2．1 样品制备

2．2 间接性ELISA

2．3 点杂交

3 结果

3．1 过敏原TBa各表位区段的ELISA检测

3．2 过敏原TBa各表位区段的点杂交检测

3．3 E1及其各突变体蛋白的ELISA检测

3．4 E1及其各突变体蛋白的点杂交检测

4 讨论

参考文献

个人简历

硕士期间发表论文

参加学术交流会议情况

致谢

声明