基于NMR款冬植物代谢组学研究

摘要

选题依据:款冬花是临床常用止咳化痰类中药，主治咳嗽气喘，痰咯不畅、咳血、肺虚、久咳、番咳等症。传统用药经验认为以朵大、色紫红、无花梗者为佳，且临床上常以花蕾入药;采收时间是在种植当年冬至前后地冻之前，花蕾未出土且苞片显紫色时，开花后药材质量降低，而且花开后不能入药。近年来国内外对款冬花的研究相当多，主要从化学成分、药理、毒理学进行研究;加工栽培、胚胎发育等方面也进行了研究。然而近年来款冬需求量增大，而供应又不足，市场上出现了花梗，根等掺伪品;不同产地款冬花在市场上也大量销售;而欧洲国家则出现以款冬叶子代替款冬花蕾发挥止咳化痰作用的。对于“款冬花在冬至前后采集质量佳”这一传统用药经验，非传统用药部位能不能入药以及发挥药效的物质基础是什么等。这些问题目前未曾有人用现代技术手段进行研究。
　　目的:款冬花为山西道地中药材之一，探明款冬花药用与非药用部位在代谢产物、药效学上的差异性;花序芽发育过程中代谢产物动态变化规律以及不同产地款冬花均一性。
　　方法:本论文以不同药用部位款冬花药材为实验材料，采用基于NMR的植物代谢组学技术和多种多元统计学方法进行化学成分的比较。同时采用小鼠氨水引咳法及酚红祛痰法比较不同药用部位（花蕾、叶、根、梗）的止咳化痰作用;同时采用多维分析方法对款冬的药效学和化学成分进行了相关性分析，找出一些和药效有关的物质成分。在明确花蕾是款冬花传统药用部位的基础上，我们采用所建立的基于NMR的植物代谢组学方法对不同发育阶段、不同产地、不同生长类型、不同贮存年限的款冬花蕾进行代谢组研究。
　　结果:(1)款冬不同器官（花蕾、叶、根）代谢组学评价。以河北蔚县款冬药材为研究对象，采用基于NMR的代谢组学方法进行代谢组的对比。通过多元统计学分析，我们得出花蕾、叶、根这三个器官在散点图上能明显分开;以花蕾为比较对象，对这三个器官进行两两分析，具体结论为:①叶子和花蕾能明显分开，代谢组成明显不同:绿原酸、芦丁、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、马来酸、富马酸、脂肪酸在叶子中含量较高;蔗糖、葡萄糖、胆碱、苹果酸、倍半萜类化合物在花蕾中含量较高。②花蕾和根能明显分开，代谢组成明显不同:苏氨酸、丙氨酸、苹果酸、甲酸、蔗糖、咖啡酸、绿原酸、芦丁、倍半萜类化合物含量在花蕾中较高;缬氨酸、乙酸、脯氨酸、天冬氨酸、琥珀酸、胆碱、葡萄糖、甾体类化合物在根中含量较高。
　　(2)款冬花蕾和花梗代谢组评价。市售款冬花药材掺伪现象严重，花蕾中掺有大量花梗，影响中医疗效。我们从市场上购买了不同批次的款冬花，采用多元统计学方法比较了二者的代谢组，发现花蕾和花梗能明显分开，代谢组成也明显不同:咖啡酸、绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎尼酸、芦丁、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、胆碱、乙酸、甲酸、葡萄糖、倍半萜类化合物含量在花蕾中含量较高;异亮氨酸、亮氨酸、琥珀酸、苹果酸、天冬氨酸、蔗糖、甾体类化合物、脂肪酸在花梗中含量较高。
　　(3)款冬不同器官（花蕾、叶、根、花梗）药效学评价以及药效学与代谢组学相关性分析。采用了小鼠浓氨水引咳法和小鼠气管段酚红法评价款冬止咳化痰作用。药效学实验表明:叶子和花蕾止咳化痰效果明显，而根和花梗几乎无止咳化痰效用。相关性分析结果显示绿原酸、3，5-二咖啡酰基奎尼酸、芦丁等化合物与款冬止咳化痰药效学作用相关性较大。
　　(4)不同发育阶段款冬花代谢组学评价。我们以河北蔚县5个不同发育时期的款冬花蕾为研究对象，进行了代谢组学评价。结果显示这5个时期款冬花代谢组成明显不同，本研究结果与中医传统用药经验是一致的，即花蕾发育初期和开花后其代谢产物组成与传统采收期差异较大，均不能入药。
　　(5)为了对款冬花药材的均一性进行考察，我们从药材市场，药材种植基地，药店等收集了不同产地，种植方式及不同贮存年限的款冬花药材，采用基于NMR的代谢组学技术手段对其质量均一性进行了评价。结果显示，这些样品大致可以3类。即蜜炙和未经过蜜炙的样本能明显分开;山西产款冬药材和其它产地款冬药材能明显分开;野生型药材和栽培型药材也能明显分开;说明款冬花的质量会因加工方式、产地及种植方式的不同而不同。从贮存年限上观察款冬花的代谢成分，发现款冬花的化学成分由于贮存年限的不同也会发生一定程度的变化。
　　以上从代谢组学和药效学进行的研究，明确了款冬不同器官的化学和药效学的差异，即款冬花蕾、叶、根、花梗代谢组成明显不同，花蕾、叶止咳化痰作用明显，根、花梗止咳化痰作用不明显;通过与药效学相关性分析，初步确定了止咳化痰相关活性成分;不同发育阶段款冬花蕾代谢组学分析，证实传统采收期的合理性;采用代谢组学技术对不同产地，种植方式及贮存年限款冬花蕾均一性进行了评价，发现这些不同来源的款冬花蕾能分开，代谢组成不同。较为系统地对款冬花的化学和药效学进行了研究，科学系统地诠释中医药理论，对开拓款冬花研究思路具有重要意义。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 立题背景和意义

1．2 研究内容、技术流程图及创新点

第二章 文献综述

2．1 款冬花研究进展

2．1．1 化学成分

2．1．2 药理研究

2．2 基于NMR植物代谢组学研究进展

2．2．1 基于NMR植物代谢组学研究方法

2．2．2 基于NMR植物代谢组学数据处理方法

2．2．3 基于NMR植物代谢组学的应用

2．3 止咳化痰药理学研究概述

2．3．1 止咳药理研究方法

2．3．2 化痰药药理研究方法

第三章 款冬不同器官(花蕾、叶、根、花梗)代谢组学研究

3．1 引言

3．2 实验材料及仪器

3．2．1 实验材料

3．2．2 试剂

3．2．3 仪器

3．3 款冬NMR代谢组学方法的建立

3．3．1 备样方法的选择

3．3．2 1H-NMR测定

3．3．3 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 结构指认

3．4．2 款冬花蕾、叶、根、花梗代谢组学分析

3．5 本章小结

第四章 款冬不同器官(叶、花蕾、根、花梗)止咳化痰药效学研究及其与代谢组学相关性分析

4．1 引言

4．2 实验材料及仪器

4．3 止咳化痰动物实验

4．3．1 小鼠氨水引咳法(浓氨水引咳实验)

4．3．2 小鼠酚红祛痰法

4．3．3 统计学处理

4．4 结果与分析

4．4．1 款冬花蕾、叶子、根、花梗止咳化痰作用的比较

4．4．2 款冬花蕾、叶子、根、花梗药效学与代谢组学相关性分析

4．5 本章小结与讨论

第五章 不同发育阶段及不同来源款冬代谢组学研究

5．1 引言

5．2 实验材料及方法

5．3 结果与分析

5．3．1 不同发育阶段款冬代谢组学研究

5．3．2 不同产地、生长类型及贮存年限款冬代谢组学研究

5．4 本章小结

第六章 总结与展望

6．1 研究工作总结

6．2 展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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