一种基于1H NMR代谢组学对人参不同部位粉体真伪的鉴别方法

摘要

本发明一种基于1H NMR代谢组学对人参不同部位粉体真伪的鉴别方法，属于植物代谢组学技术领域；结合主成分分析(PCA)、偏最小二乘法辨别分析(PLS‑DA)等多元统计分析，对人参主根、侧根及芦头3个部位化学成分进行对比，比较各个部位化学组成差异，探究人参不同部位鉴定的科学内涵。本发明直接、系统、精准，从整体化学组成差异上找出了各部位相应的差异性成分，以期从整体物质组成角度阐明符合中医药学整体观的人参品种鉴别的科学内涵，为市售人参粉体真伪优劣提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于植物代谢组学技术领域，具体涉及应用

背景技术

人参是一种传统名贵中药，又称为亚洲参，人参味甘、微苦，性微温，大补元气，复脉固脱，补脾益肺，生精养血，安神益智。现代药理学研究表明人参具有多方面的药理作用，其对神经细胞损伤有保护作用，有改善记忆，保护脑组织，镇静、镇痛，抗衰老，抗肿瘤，抗抑郁，提高机体免疫功能，促进生殖、消化、造血，调节内分泌，改善心血管和学习记忆。目前，已明确的人参化学成分有皂苷、多糖、聚炔醇、挥发油、蛋白质、多肽、氨基酸、有机酸、维生素、微量元素等。现代医学和研究普遍认为人参皂苷是其主要有效成分和活性成分。人参被称为“百草之王”，在中国使用历史悠久，是驰名中外的珍稀中药材和名贵补品。如今人参市场伪品混用现象屡见不鲜，特别是食品和草药市场出售的商品人参通常更容易遭到掺假，主要存在的假冒形式有：第一，市场上常以与人参形似的野豇豆、栌兰、山莴苣、商陆、华山参、莨菪、紫茉莉、桔梗、金钱豹等药材冒充人参；第二，以西洋参或三七粉体冒充人参粉体；第三，以劣质人参冒充质优人参。尤其是其微粉、超微粉等粉碎体，为了赚取高额利润，在定价和产品分级时，市场将劣质人参产品粉碎以高价出售，使人参市场鱼目混珠，秩序张乱，严重影响了人参作为中国“百草之王”的声誉和广大老百姓的生活和健康，减少创造一定的实际价值。因此，如何对人参掺假和伪造现象进行精准、快速、经济的鉴别已经成为人参市场持续发展的有效途径，也在保证人参质量中起着重要的作用。

代谢组学技术以代谢物质群体指标分析为基础，借助高通量检测和数据处理手段，具有整体观的研究思路，特别适合中药这种多成分、复杂体系的分析。利用代谢组学的思维方式和分析方法在整体上分析人参各部位初生代谢产物和次生代谢产物的成分差异及成分含量差异，从而能综合全面的评价人参的内在品质。基于核磁共振的代谢组学分析方法是一个简单、快速、系统、整体的分析平台，能同时检测到各种组群化合物的优势，此方法已成功运用于多种药物的分析中，如中药复方制剂药效研究(Xiao-fen Zheng,Jun-sheng Tian,Jie Xing,Peng Liu,Xue-mei Qin.Analysis of the restorative effectof Bu-zhong-yi-qi-tang in the spleen-qi deficiency rat model using 1H-NMR-based metabonomics[A].中国药学会中药和天然药物专业委员会.第十四届全国中药和天然药物学术研讨会论文摘要[C].中国药学会中药和天然药物专业委员会:,2014:2.)当归和欧当归的药效鉴别(Zhen-Yu Li,Zheng-Zheng Zhang,Xue-Mei Qin,Guan-Hua Du.NMRbased metabolic fingerprinting and Biological Comparison of Danggui andEuropean Danggui[A].中国药学会.2014年中国药学大会暨第十四届中国药师周论文集[C].中国药学会:,2014:21.)人参、西洋参和三七的鉴别(Wenzhi Yang,Xue Qiao,Kai Li,Jingran Fan,Tao Bo,De-an Guo,Min Ye.Identification and differentiation ofPanax ginseng,Panax quinquefolium,and Panax notoginseng by monitoringmultiple diagnostic chemical markers[A].中国药学会.2014年中国药学大会暨第十四届中国药师周论文集[C].中国药学会:,2014:21.)人参年限鉴别(Seung-Ok Yang,Yoo-SooShin,Sun-Hee Hyun,Sayeon Cho,Kyong-Hwan Bang,Dongho Lee,Seung Phill Choi,Hyung-Kyoon Choi.NMR-based metabolic profiling and differentiation of ginsengrootsaccording to cultivation ages[A].Journal of Pharmaceutical andBiomedical Analysis 2012:58；19–26.)等研究。

多元统计分析是针对多成分、多靶点复杂中药分析的最常用的化学计量学方法。主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)等已经广泛用于食品、药品和农产品等的快速识别，PCA利用降维思想，将观测指标的维数降低，已获得较低维数的指标，可大量的减少分析的数据而能够最大量的获得可供参考的数据信息。同时，PCA是一种非监督性的的数据分析平台，想要获得更有力的信息，需对数据进一步考证分析，还需进行有监督的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，可以提供除回归方程之外的主成分分析和典型相关分析的相关信息。

发明内容

面对技术背景中提到人参市场中存在的问题，本发明就此提出了一种基于

为实现上述目的，本发明的一种基于

一种基于

步骤S1，对人参样品进行不同部位的分离处理；

步骤S2，对所述步骤S1分离后的人参样品进行进一步提取处理；

步骤S3，对所述步骤S2提取后的人参样品进行核磁测定前处理；

步骤S4，对所述步骤S3核磁测定前处理好的人参样品进行

步骤S5，对所述步骤S4

步骤S6，对所述步骤S5整理好的数据进行多元统计分析，得出人参各部位差异性代谢产物，具体为，将所述步骤S5整理好的数据导入Simca-p+11软件进行多元统计分析，得到相应的分析结果；

步骤S7，根据所述步骤S6多元统计分析得到的得分投影图和载荷图结合所得到的人参各部位差异性代谢产物组成及其相对含量对人参样品进行综合性分析，得出结论。

进一步，所述步骤S1，将人参根分为主根、侧根和芦头3个部位。

进一步，所述步骤S2，将步骤S1的不同部位的人参样品加入两相溶剂进行超声处理，离心后分为上下两层，水浴蒸干即可。

进一步，所述步骤S4，对所述步骤S3处理完成的人参样品进行

进一步，所述步骤S5，使用MestReNova软件进行处理，最终将

进一步，所述步骤S6，将所述步骤S5得到的所有数据导入Simca-p+11软件进行多元统计分析，得到相应的图示和数据。

进一步，所述步骤S7，将所述步骤S6得到的得分投影图和载荷图结合所得到的人参各部位差异性代谢产物组成对人参样品进行综合性分析。

进一步，所述步骤S1，取10～15个干燥园参，分离成主根、侧根、芦头3个部位，分别过50～70目筛得粉体，分装备用。

进一步，所述步骤S2，称取一定质量的步骤S1制的的粉体，每个部位取5批，每批准确称取1g，加甲醇-水-氯仿30mL，进行超声萃取20min～40min，室温3000r/min离心15～35min，过滤上层，60℃下氮气吹干。

进一步，所述步骤S3，准确称取步骤S2中所得甲醇-水相干膏20mg，加入500～700μL含0.01％～1％TSP的磷酸盐缓冲液溶解并离心后，移取400～500μL上清液和40～60uLD

本发明的一种基于

全面性，与以往鉴定技术相比，该发明更全面，从整体上阐明人参的代谢产物，能系统的比较代谢产物之间的差异；

关联性，主成分分析(PCA)与偏最小二乘法(PLS-DA)层层递进，环环相扣，相互关联，保证了实验结果的准确性；

准确性，丰富的核磁数据结合现代高科技分析软件，能保证实验结果的稳定、可控，具有宏观准确性和微观精确性；

广泛性，该发明具有外延性，在一定的程度上也适合于其他中药的分析鉴定和质量保证；

简便性，该鉴定方法简单、方便、快速、经济，适合于市场和一般个体应用。

附图说明

图1为实施例1中人参不同部位(主根、侧根和芦头)的

图2为实施例1的PCA得分图(ZG:主根CG：侧根LT：芦头)。

图3为实施例1有监督的PLS-DA排列实验图。

图4为实施例1的PLS-DA图(ZG:主根CG：侧根LT：芦头)。

具体实施方式

为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种基于

实施例1：

本实施案例涉及一种基于

步骤一，取12个形状均一的干燥生晒园参，分别对其进行主根、侧根及芦头的分割，将分离的每个部位都进行粉碎，粉体粒度为60目，每个部位有5份样品，分装备用；

步骤二，将每个样品的人参粉末各量取1g，加7.5ml的水、7.5ml甲醇、15ml三氯甲烷进行超声提取30min。取出，离心(3000r/min 15-35min)，提取液分为两层(上层为水相，下层为有机相)，将上下层分别用滤纸过滤于50ml离心管中，置于水浴锅中用风扇吹至半固体，再将其放在氮吹仪于60℃吹至干燥即可，放于干燥器中备用；

步骤三，精密称取水相干燥后膏子20mg于2mL离心管中，溶于600μL磷酸盐缓冲液(含0.05％TSP)并离心(11180×g，10min)后，移取450μL上清液和50uL D

步骤四，样品在BRUKER AVANCEIII500谱仪上完成核磁检测，

步骤五，将40份样品的

步骤六，将经MestReNova分析的数据用Excel表综合整理，导入Simca-p+11软件进行多元统计分析，即用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)，得到相应的图示和数据。

步骤七，将所得的得分投影图和载荷图结合人参各部位差异性代谢产物组成对人参样品进行综合性分析结果如下：

对人参代谢产物进行

氨基酸包括亮氨酸Leucine(δ0.95,d,7.0Hz)，缬氨酸Valine(δ0.98,d,7.0Hz)，苏氨酸Threonine(δ1.34,d,6.5Hz)，丙氨酸Alanine(δ1.49,d,7.2Hz)，脯氨酸Proline(δ1.99-2.09,m)，谷氨酸Glutamate(δ2.10-2.17,m；δ2.34-2.37,m)，谷氨酰胺Glutamine(δ2.45,m),天冬氨酸Aspartate(δ2.82,dd,17.1Hz,3.7Hz),天冬酰胺Asparagine(δ2.84-2.88,m；δ2.94-2.97,m),胆碱Choline(δ3.18,s)，结果显示人参代谢产物氨基酸的化学位移在δ0.98到δ3.18。有机酸包括乙酸Acetate(δ1.90,s)，丙酮酸Pyruvate(δ2.38,s),α-酮戊二酸2-Oxoglutarate(δ3.02,t,7.4Hz)，其化学位移在δ1.9到δ3.2。糖类包括葡萄糖Glucose(δ3.45–3.48,m；δ3.56,dd,9.9Hz,3.8Hz；δ3.72–3.91,m；5.22d,3.8Hz)and蔗糖Sucrose(δ3.47,t,9.6Hz；3.56,dd,10.0Hz,3.9Hz；δ3.66,s；δ3.76,t,9.5Hz；δ3.79–3.91,m；δ4.05,t,8.6Hz；δ4.22,d,8.8Hz；δ5.42,d,3.9Hz)其化学位移在δ3.45到δ5.42。

数据分析：

图1清楚的描述了主根、侧根及芦头在PCA图(PC1:35.4％；PC2:27.8％)上的差异；图2采用无监督的主成分分析(PCA)清楚的描述了主根、侧根及芦头在PCA图(PC1:35.4％；PC2:27.8％)上的差异，可以发现主根、侧根及芦头组间分离趋势明显。有监督的PLS-DA排列实验结果(R2＝0.978,Q2＝0.950)显示模型有效稳定，能够建立良好的模型，预测性能高(图3)。PLS-DA分析显示人参3个部位可明显分开(图4)，说明人参的主根、侧根及芦头的组间分布确实存在一定差异。

结果表明的代谢产物包括亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、葡萄糖、蔗糖、苏氨酸、谷氨酰胺、胆碱、谷氨酸，丙酮酸，丙氨酸的分离情况，主根主要含有葡萄糖与蔗糖；侧根主要含有谷氨酰胺；芦头主要含有亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、胆碱及丙酮酸，其中，芦头氨基酸、有机酸等代谢产物的含量最高，其次是侧根，主根代谢产物的含量最低。

本发明通过

本法可全面、系统的对人参代谢产物进行整体分析，避免经典范式对人参鉴别的片面性，操作简单、快速，结论准确可靠。

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。