基于色谱技术的款冬植物代谢组学研究

摘要

选题依据:款冬花为一种中医临床常用的止咳化痰药，采用花序芽即未开放的花蕾作为药用部位。其花序芽形成于栽种当年秋季，于栽种当年立冬前后，当花蕾尚未出土、苞片呈紫红色时采收，开花则是在来年早春。由于花序芽的发育是在无光照的地下进行的，较难观察其整个发育过程，给花蕾的采收带来了一定的困难，缺乏客观合理的科学指导。在欧洲的药典中，款冬花是以叶子为药用部位入药的，而国内药典则收载的是花蕾，两者的异同有待于研究和分析。目前市售的中药都存在着质量参差不齐的状况，而款冬也不例外。市场上很多款冬花蕾中掺杂着一些花梗及根茎等非药用部位，以次充优。故急需对这些问题从科学的角度进行阐述和解释。植物代谢组学技术则是研究植物体的整体代谢产物及其变化规律的一种新的系统生物学方法。它是采用具有高通量、高灵敏度和高精确度的现代分析测试技术，对植物样品的代谢产物的异同和变化进行探寻。除此之外，款冬中还存在着一类肝毒性吡咯里西啶生物碱，对不同款冬样品中生物碱的含量研究也是个空白，对其进行含量测定及安全性评价就显得尤为重要。
　　目的:(1)建立基于GC-MS和UPLC的款冬植物代谢组学研究方法，比较不同样品代谢物组的整体差异性，寻找到差异代谢产物，以确定药材最佳采收期，科学阐释中国和欧洲用药部位不同的原因，以及明确非药用部位作为杂质的合理性。(2)建立基于UPLC的生物碱含量测定方法，以确定其用药安全性;通过各个样本进行比较分析，找出生物碱含量与药效的关系。
　　方法:(1)采用溶剂提取法制备款冬不同产地、不同发育阶段和不同部位的样品，分别对其进行GC-MS和UPLC分析，获得指纹图谱;GC-MS代谢产物的结构指认通过NIST数据库检索和标准品对照确定，而UPLC的代谢产物则是通过对照品和文献进行指认。之后将数据预处理后导入SIMCA-P软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，得到相应的得分图和载荷图，得分图是对不同组别进行分类比较;载荷图用来寻找引起组间差异的代谢物。
　　(2)对款冬花不同产地、不同发育阶段、不同器官以及含款冬的中药复方进行了生物碱的提取，通过UPLC技术对其进行含量测定，比较不同样本中的生物碱含量高低。
　　结果:(1) GC-MS和UPLC代谢组学分析结果:成功建立了款冬花GC-MS和UPLC两种分析方法，共指认得到了54种初级代谢产物和18种次级代谢产物。不同产地款冬花的分析结果:PCA分析显示山西产地野生品聚为一类，蜜炙样品聚为一类，而其他产地栽培品聚在一起。不同发育阶段款冬花蕾的多元统计分析结果:不同发育阶段的款冬样品有很明显的分开趋势，且是逐步变化的，可以看出发育初期和开花后的款冬样品位于得分图的两端，将这两组样品分别与位于中间的传统药用部位进行比较，其差异主要体现在9个初级代谢产物上和7个次级代谢产物上。不同器官款冬植物的多元统计分析结果:花蕾、根、叶子和花梗四个不同器官在得分图中能明显的分开，各自聚为一类。将根、叶子和花梗均与花蕾进行比较可以寻找得到每两个组之间的差异代谢产物。
　　(2)对款冬生物碱进行提取分离，得到肾形千里光碱（senkirkine）单体。并且采用UPLC对其进行含量测定。不同产地研究结果显示山西、河北和甘肃产地的生物碱含量均在90μg/g以上，其他产地则较低，而蜜炙样品的含量在80μg/g以下;不同发育阶段研究结果显示senkirkine含量逐渐升高，在12月份升至最高，开花后又降低;不同器官研究结果显示叶子中的senkirkine含量最高，花蕾次之，花梗和根中的senkirkine含量相对较低。含款冬的不同中成药中均没有检测到senkirkine。
　　结论:(1)本实验成功地建立了基于GC-MS和UPLC分析技术的款冬植物代谢组学方法，从整体化学角度对不同产地、不同发育阶段和不同器官的款冬样品进行分析和评价。不同产地结果显示:山西产地野生品种与甘肃、河北等产地栽培品有明显不同，蜜炙样品与生品差异也较大。不同发育阶段结果显示:在花蕾发育形成过程中，初级代谢产物和次级代谢产物都发生了明显的变化，但是其中的规律还有待于更加深入的探寻;不同器官结果显示:欧洲药用部位叶子与中国传统药用部位花蕾所含的化合物较多，而根和花梗中化学成分较少。这为款冬的质量评价提供了新的思路和方法。
　　(2)成功建立了款冬中senkirkine含量测定的UPLC分析方法，并对不同产地、不同发育阶段、不同器官款冬和含款冬的市售中成药都进行了senkirkine的含量测定。不同产地结果显示:山西、河北和甘肃等主产地的senkirkine含量最高，东北、青海和河南等非主产地的senkirkine含量较低，说明senkirkine可以作为主产地与非主产地判别以及款冬质量及药效评价的一个指标，且蜜炙款冬senkirkine含量降低的原理尚不明确。不同发育阶段结果显示:senkirkine含量在花蕾采收时期较高，在花蕾发育初期和开花后含量均较低，表明款冬药效成分含量和senkirkine的含量可能呈正相关。不同器官结果显示:叶子与花蕾中的senkirkine也较花梗和根中的高，也验证了款冬药效和senkirkine的含量可能呈正相关的结论。含款冬中成药结果显示:橘红丸中senkirkine含量为0.0512μg/丸，低于德国行政部门限量规定。川贝雪梨膏和蜜炼川贝枇杷膏复方中没有检测到senkirkine，故表明中成药的用药安全性是可以保证的。这为款冬安全用药提供了科学依据和指导。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 立题背景和意义

1．2 本课题的研究思路，技术路线图，研究内容和创新点

第二章 文献综述

2．1 款冬花简介

2．1．1 本草考证

2．1．2 款冬花的形态研究

2．1．3 化学成分研究进展

2．1．4 药理活性研究进展

2．2 植物代谢组学研究进展

2．2．1 代谢组学历史及植物代谢组学简介

2．2．2 研究方法

2．3 款冬花的质量评价研究概况

2．3．1 中药质量控制现状

2．3．2 款冬花的质量控制现状

第三章 基于GC-MS的款冬代谢组学研究

3．1 引言

3．2 仪器与材料

3．2．1 材料与试剂

3．2．2 仪器与设备

3．3 实验方法

3．3．1 备样方法

3．3．2 GC-MS方法

3．3．2 数据分析方法

3．3．3 多元统计分析

3．4 实验结果

3．4．1 不同发育阶段款冬的GC-MS代谢组学分析结果

3．4．2 不同器官款冬的GC-MS代谢组学分析结果

3．5 结论与讨论

第四章 基于UPLC的款冬代谢指纹研究

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．3 实验方法

4．4 实验结果

4．4．1 不同产地款冬花药材UPLC分析

4．4．2 不同发育阶段款冬药材的UPLC代谢组学分析

4．4．3 不同器官款冬的UPLC代谢组学分析

4．5 结论与讨论

第五章 款冬中吡咯里西啶生物碱的含量测定

5．1 引言

5．2 标准品制备

5．2．1 仪器与材料

5．2．2 实验方法与结果

5．3 肾形千里光碱的含量测定

5．3．1 材料与仪器

5．3．2 实验方法

5．3．3 实验结果

5．4 结论与讨论

第六章 总结与展望

6．1 研究工作总结

6．2 展望

6．3 学习心得

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

个人简况与联系方式

声明