远志药材的传统辨状论质与现代品质评价的相关研究

摘要

选题依据：中药材是中药饮片和中成药的原料，是一类特殊商品，在长期以来的市场交易中形成了凭借“看货评级，分档议价”来判定药材品质的传统经验。经对上述经验进行归纳与总结，逐渐形成了药材商品规格，并以商品规格等级作为判别药材品质优劣的标准。但随着野生药材的引种驯化及大面积推广种植，人工的过度干预导致中药材尤其是根茎类中药材的品质发生了极大的变化，造成这些药材在市场流通中，规格等级划分及品质鉴别等与传统认识产生了分歧，导致出现“同价（质）不同质（价）”、“优价（质）不优质（价）”等不合理现象，无法确保中药材临床疗效的一致性，且严重影响到了药材市场的长期稳定与繁荣。
　　鉴于这种情况，本研究以山西道地药材远志为例，从传统的药材鉴别经验，即“辨状论质”为出发点，结合市场及产地调研，首先对现行的1984年颁布的《七十六种药材商品规格标准》中远志商品规格标准进行修订，然后利用化学分析方法对远志药材中的化学成分进行定性及定量分析，之后利用两种 DNA分子标记技术（ISSR与AFLP）构建远志药材的DNA谱库，最终建立商品规格标准、化学成分及DNA谱库三者间的相关性，最终探索优质中药材的鉴别方法。
　　目的：
　　1.修订远志药材的商品规格等级标准，便于远志药材在市场中更好地流通。
　　2.对远志药材中的化学成分进行定性及定量分析，阐明不同规格等级的远志药材间的化学差异，依据化学分析方法评价远志药材商品规格等级用于评价远志药材质量优劣的合理性。
　　3.利用ISSR及AFLP两种DNA分子标记技术，构建远志药材的DNA指纹图谱，明确远志药材规格等级、化学成分含量与 ISSR及 AFLP分子条带的关系，在DNA分子水平上对远志药材商品规格等级的划分提供理论依据。
　　4.针对与远志药材规格等级、化学成分含量相关的特异性ISSR序列设计出能够快速鉴别远志药材化合物含量高低的特异性PCR引物，用于优质远志药材的常规鉴别。
　　方法：
　　1.对远志药材进行市场及产地调研，修订远志药材现行的商品规格等级标准。
　　2.建立远志药材UPLC指纹图谱，并采用整合UHPLC-Q Exactive轨道肼高分辨质谱技术对UPLC指纹图谱中共有峰进行归属，并采用UPLC法同时测定7批远志药材中6个糖酯类（sibiricose A5、sibiricose A6、glomeratose A、3，6′-disinapoyl sucrose、tenuifoliside A、tenuifoliside C）和4个口山酮类（lancerin、sibiricoxanthone B、7-O-methyl mangiferin、polygalaxanthone III）化合物的含量，从化学分析层面分析不同规格（野生与栽培）及不同等级（大筒与小筒）远志药材间的化学差异，用化学手段评价远志药材商品规格等级的合理性。
　　3.利用ISSR及AFLP两种DNA分子标记技术，构建远志药材的DNA指纹图谱，利用相关性分析筛选出与远志药材商品规格等级、化学成分含量相关的特异性ISSR及AFLP分子条带，并建立商品规格等级、化学成分含量与DNA分子条带间的关系。
　　4.将与远志药材规格等级、化学成分含量相关的特异性ISSR条带进行回收、克隆、测序，对目标基因序列进行生物学分析，针对目标基因序列设计出能够快速鉴别远志药材化合物含量高低的特异性PCR引物。
　　结果：
　　1.根据市场及产地调研的实际情况，对远志药材的商品规格等级进行修订，提出更加贴近实际、符合市场流通情况的远志药材商品规格等级标准草案。
　　2.指纹图谱相似度结果表明不同规格远志药材的相似度比较大，不同等级远志药材的相似度比较小，说明远志药材商品规格等级可在一定程度上反映远志药材的质量优劣，但仅依据商品规格等级评价远志药材的质量优劣较为片面。本研究建立利用UPLC同时测定远志药材中6个糖酯类和4个口山酮类化合物的含量，且经方法学考察，该方法稳定可靠，可用于远志药材的品质评价研究。远志药材综合质量评价函数结果表明大筒远志药材的综合品质优于中筒远志药材，除个别样品外，野生远志的整体质量优于栽培品；10个化合物的含量聚类结果及PCA分析结果相同，但聚于同一组中样品的规格及等级并不完全相同；
　　3.利用ISSR及AFLP两种DNA分子标记技术，建立了远志药材的DNA指纹图谱，利用相关性分析，筛选2条与远志规格显著相关的ISSR条带；2条与远志等级显著相关的ISSR条带；11条与远志等级显著相关的AFLP条带；31条与远志药材中化合物含量显著相关的ISSR条带；41条与远志药材中化合物含量极显著相关的AFLP条带。根据特异性DNA分子条带，可对远志药材中化合物含量高低进行推测。
　　4.将与含量显著相关的ISSR条带进行胶回收、克隆测序及序列功能分析，并设计出两条特异性PCR鉴别引物，可实现远志样品中化合物sibiricose A5、sibiricose A6、sibiricoxanthone B、glomeratose A、7-O-methyl mangiferin、polygalaxanthone III、tenuifoliside C含量高低的预测，可用于优质远志药材的常规鉴别。
　　结论：本研究依据市场及产地调研结果对现行的远志药材商品规格等级进行修订，并借用化学分析与DNA分子标记技术，阐述远志药材商品规格标准用于评价远志药材质量优劣的合理性，发现商品规格标准可在一定程度上反映远志药材的质量优劣，但仅依据商品规格标准评价远志药材的质量优劣，难以得到比较全面的结果。本研究设计出的两对特异性 PCR鉴别引物可对远志药材中化合物含量高低进行预测，用于优质远志药材的常规鉴别。

目录

第一章 引言

1.1 立题背景和意义

1.2 本课题的研究内容、技术流程图及创新点

第二章 文献综述

2.1 远志药材的传统品质评价研究

2.2远志药材的现代品质评价研究

2.3 DNA分子标记技术在中药材品质评价中的应用

第三章 远志药材商品规格等级标准草案的修订

3.1 引言

3.2 市场调研

3.3 产地调研

3.4 文献调研、市场调研及产地调研综合分析

3.5结论与讨论

第四章 远志UPLC指纹图谱研究及多指标成分定量分析

4.1 引言

4.2 远志UPLC指纹图谱及共有峰的归属分析

4.3 远志UPLC多指标成分含量测定

4.4 本章总结

第五章 远志商品规格等级、化合物含量与特异性条带的相关性分析

5.1 引言

5.2 远志DNA指纹图谱的ISSR分析

5.3 远志DNA指纹图谱的AFLP分析

5.4 两种DNA分子标记方法的比较及综合分析

5.5 远志商品规格等级与DNA条带的相关性分析

5.6 远志化合物含量与DNA条带的相关性分析

5.7 本章总结

第六章 特异条带序列分析及特异性PCR引物的设计

6.1 引言

6.2 与含量相关ISSR条带的克隆及序列分析

6.3 优异ISSR条带的特异性PCR引物设计

6.4 本章总结

第七章 总结与展望

7.1 研究工作总结

7.2 展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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