Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病心肌病发生发展中的作用及调控机制

摘要

目的：糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)心血管并发症的重要组成部分，也是DM患者死亡的主要原因。本课题旨在研究DCM发生发展过程中大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路的变化规律及其调控机制，完善DCM的病理生理机制，为DCM的治疗寻找新的治疗靶点和新药开发目标。
　　方法：1. 模型建立、实验分组及样本收集
　　1型糖尿病大鼠模型的建立采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)60 mg/kg，以72h后空腹血糖值(fasting blood glucose，FBG)≥16.7mmol/L，并出现多饮、多食、多尿和体重下降者为DM模型成功。按体重均衡的原则随机将非糖尿病组(non-diabetic，ND)大鼠和造模成功的DM组大鼠各分为2，4，8和12周四组，每组≥10只。分别在2，4，8和12周时测FBG，称体重(body weight，BW)，麻醉后腹主动脉取血，迅速取出心脏并剔除血管、脂肪等非心肌组织，称心脏及左心室重量(heartweight，HW;left ventricular weight，LVW)，并计算心脏指数（cardiac index，CI，HW/BW）及左心室质量指数(left ventricular weight index，LVWI，LVW/BW)。分离的左心室一部分于10％甲醛溶液中固定，另一部分于液氮中保存待用。
　　2. 2周糖尿病大鼠病理观察及指标检测
　　HE染色法观察2周大鼠心肌组织病理改变;免疫组织化学法(immunohistochemical，IHC)和Western blotting(WB)检测2周大鼠心肌Wnt2，β-catenin，c-Myc和DKK1的蛋白表达变化。
　　3. 4，8，12周糖尿病大鼠病理观察及指标检测
　　ELISA法检测空腹血浆胰岛素水平;HE及Masson三色染色法观察大鼠心肌组织病理改变;TUNEL法检测大鼠心肌细胞凋亡水平的变化;WB及IHC法检测心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达变化;qRT-PCR检测心肌组织中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白mRNA的表达变化。
　　结果：1. 糖尿病大鼠一般状况及病理组织学改变
　　与ND组比较，DM组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛无光泽，腥臊酮臭味加重、稀便等。DM组大鼠FBG明显升高，FINS水平、HW及LVW均明显降低，CI及LVWI均高于ND组。HE结果显示2周DM组大鼠心肌出现局灶性心肌细胞变性、坏死，但未观察到明显的心肌肥大。4，8，12周时DM组大鼠心肌胶原沉积面积持续性升高，心肌细胞横截面面积明显高于ND组，表明心肌纤维化及心肌肥大的出现;TUNEL结果显示，4，8，12周时DM组大鼠心肌细胞凋亡率明显升高，并呈时间依赖性。
　　2. 2周糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白的表达
　　WB实验结果表明，2周DM大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc蛋白的表达相对于ND组明显增加(P＜0.01)，但DKK1的表达变化不明显。IHC结果显示，ND组大鼠心肌中各蛋白表达均匀分布，DM组大鼠心肌中Wnt2、β-catenin和c-Myc的表达均明显增加，其中β-catenin伴随少量核表达，c-Myc在细胞质和细胞核中表达均增加。
　　3. 4，8，12周糖尿病大鼠心肌Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及其mRNA的表达
　　实验结果显示DM心肌中Wnt2，β-catenin和c-Myc的表达在4，8，12周时随着DCM的发展逐渐增加（P＜0.01），其mRNA水平也逐渐增加(P＜0.05)，而TCF4及其mRNA水平仅在8周和12周时表达高于ND组（P＜0.01）。其中，β-catenin在4周DM心肌中表达增加，并开始进入细胞核，在8周和12周时，其细胞核表达逐渐增加并伴随细胞质中表达的减少(P＜0.01);而c-Myc在细胞核和细胞质中的表达随着DCM的发展均逐渐增加(P＜0.01)。DKK1及其mRNA的水平在4周DM心肌中表达明显高于ND组，随后随着信号通路的激活在8周和12周时表达显著性降低但仍高于ND组(P＜0.01)。此外，P-GSK3β(Ser9)在4周DM大鼠心肌中表达无明显增加，但在8周和12周时其表达逐渐增加，并伴随GSK3βmRNA水平的降低(P＜0.01)。
　　结论：1. STZ诱导的大鼠成模后，心肌凋亡细胞增加，伴随明显的心肌细胞坏死、心肌肥大和心肌纤维化等心肌损伤。
　　2. DM心肌中Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白及mRNA的水平随DCM的发生发展呈不同程度的增加，表明DM诱导Wnt/β-catenin信号通路的激活。
　　3. Wnt/β-catenin信号通路的激活参与DCM的发生发展过程，开发该信号通路的特异性抑制剂将给DCM患者带来福音。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

1 糖尿病心肌病

2 Wnt／β-catenin信号通路

3 Wnt／β-catenin信号通路与心肌损伤的研究进展

4 本课题研究目的和意义

第一部分 早期糖尿病大鼠心肌Wnt／β-catenin信号通路的变化

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 试剂

1．3 试剂配制

1．4 主要仪器设备

2 实验方法

2．1 模型建立及分组

2．2 标本收集

2．3 苏木素-伊红(HE)染色

2．4 Western blotting(WB)

2．5 免疫组织化学法(IHC)

2．6 统计学分析

3 实验结果

3．1 糖尿病大鼠的一般特征

3．2 糖尿病大鼠心肌病理结构的变化

3．3 糖尿病大鼠心肌Wnt2，β-catenin，c-Myc及DKK1的变化

4 讨论

第二部分 Wnt／β-catenin信号通路在糖尿病心肌病发展过程中的变化

1 实验材料

1．1 实验动物

1．2 试剂

1．3 试剂配制

1．4 主要仪器设备

2 实验设计与实验方法

2．1 模型建立及分组

2．2 标本收集

2．3 ELISA法检测血浆胰岛素水平

2．4 HE染色

2．5 Masson三色染色

2．6 TUNEL法检测心肌细胞凋亡

2．7 Western blotting(WB)

2．8 Quantitive real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)

2．9 免疫组织化学法(IHC)

2．10 统计学分析

3 实验结果

3．1 糖尿病大鼠的一般特征

3．2 糖尿病大鼠心肌病理结构的变化

3．3 糖尿病对大鼠心肌细胞凋亡的影响

3．4 糖尿病大鼠心肌Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白的变化

3．5 糖尿病大鼠心肌Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白mRNA的变化

3．6 糖尿病对大鼠心肌GSK3β及其磷酸化的表达的影响

3．7 糖尿病大鼠心肌Wnt／β-catenin信号通路相关蛋白的表达

4 讨论

结论

参考文献

综述 Wnt信号通路与心血管疾病的研究进展

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

已发表SCI文章