SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路在糖尿病心肌病发生发展过程中的变化及奥美沙坦酯的干预作用研究

摘要

研究目的：糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病（diabetes mellitus， DM）心血管并发症中一种独立、特异的心肌病，与糖尿病患者发生心力衰竭和死亡率升高密切相关，是DM患者死亡的主要原因。本课题通过建立2型糖尿病大鼠模型，研究DCM发生发展过程中大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的变化，探讨其可能的调节机制，并通过奥美沙坦酯的干预作用来研究ARB类药物的心肌保护作用，旨在完善DCM的病理生理及调控机制，探究DCM的药物治疗，为DCM的治疗寻找新的治疗靶点。
　　研究方法：
　　1.模型建立
　　按体重均衡的原则将250只SD大鼠随机分为非糖尿病组（non-diabetic，ND group），糖尿病模型组（DM group）。ND组始终饲以普通饮食，DM组采用高脂流质灌胃，两组动物均自由饮水。5周后，DM组大鼠禁食12 h，颈静脉窦取血检测血清总胆固醇（total cholesterol，TC）,甘油三酯（triglyceride，TG）等生化指标，选择高脂模型成功大鼠腹腔注射链脲佐菌素造模，72 h尾静脉采血检测空腹血糖值（fasting blood glucose， FBG），以FBG≥11.1 mmol/L，胰岛素敏感指数降低，认为2型糖尿病大鼠模型成功。2.2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的变化研究
　　（1）实验分组：
　　按照体重均衡的原则，将造模成功的DM组大鼠随机分为2，4，8和12周组，每组8只，维持高脂灌胃，直到实验所设计的时间点。空白对照组常规正常饮食。
　　（2）研究过程：
　　①.血生化检测血清FBG、TG、TC、HD-C、LDL-C水平；
　　②.超声心动图检测心功能改变，记录分析LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs、LV Mass、FS、LVEF、LVMass/BodyWeight变化情况；
　　③. ELISA法检测空腹血浆胰岛素（FINS）、血清CTnI水平；
　　④. HE染色法观察大鼠心肌组织病理改变；
　　⑤.免疫组织化学法（immunohistochemical，IHC）检测大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、sFRP2、Dact1及SIRT1的蛋白表达情况；
　　⑥. Western blotting（WB）检测大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、TCF4、DKK1、sFRP2、Dact1、SIRT1及AT1-R蛋白表达变化；
　　⑦. RT-PCR检测相关基因mRNA的表达变化。
　　3.奥美沙坦酯对2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的干预作用
　　（1）实验分组：
　　将造模成功的DM组大鼠随机分为2，4，8和12周组，每组再分为DM模型组，奥美沙坦酯（Olmesartan Medoxomil, OLM）干预组（高、中、低剂量组），达美康组（Diamicron, DIA），联合用药组（OLM+DIA），每组10只。
　　（2）研究过程：
　　①.血生化检测血清FBG、TG、TC、HD-C、LDL-C水平；
　　②.超声心动图检测心功能改变，记录分析LVIDd、LVIDs、LVPWd、LVPWs、LV Mass、FS、LVEF、LVMass/BodyWeight变化情况；
　　③. ELISA法检测空腹血浆胰岛素（FINS）及血清Ang II水平；
　　④. HE染色法观察大鼠心肌组织病理改变；
　　⑤. Western blotting（WB）检测大鼠心肌Wnt2、β-catenin、c-Myc、TCF4、DKK1、sFRP2、Dact1、SIRT1及AT1-R蛋白表达变化；
　　实验结果：
　　1.糖尿病大鼠一般状况及组织病理学改变
　　与ND组比较，DM组大鼠逐渐出现多饮、多食、多尿和消瘦，精神萎靡，皮毛无光泽，腥臊酮臭味加重、稀便等。其中，DM模型中35只大鼠血糖出现自愈现象，18只大鼠因灌胃不当出现严重肺部感染，被剔除出实验，实验造模成功大鼠197只，成功率为率78.8％。DM组大鼠FBG明显升高，FINS水平、HW及LVW均明显降低，BWI及LVWI均高于ND组。血清FBG、TG、TC、LDL-C明显升高。超声心动图数据显示， LVIDd及LVIDs值显著增大，FS、LVEF及LV Mass值显著降低。HE结果显示，2周DM组大鼠心肌无明显变化，4周出现炎性浸润，局灶性心肌细胞变性，但未观察到明显的心肌肥大。8、12周时DM组大鼠出现心肌胶原沉积，甚至坏死，心肌纤维化及心肌肥大。与DM模型组比较，OLM干预组大鼠超声心动数据显示心功能指标有所改善，心肌病理观察也显示病变有所减轻，OLM联合DIA组与单独OLM干预组比较无显著性差异。
　　2.2、型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的变化研究
　　WB及定量PCR实验结果表明，与正常对照组大鼠相比较，糖尿病组大鼠心肌Wnt2、β-catenin及下游P-GSK3β的表达在2 wk及4 wk显著增加（P<0.01），4 wk后维持在较高水平，8 wk及12 wk表达变化无显著性差异（P>0.05）；糖尿病大鼠从2 wk到12 wk过程中，TCF4、SIRT1蛋白表达与正常对照组相比表现为持续增加（P<0.05），sFRP2蛋白的表达持续降低（P<0.01），但DKK1的表达变化不明显。IHC结果显示，DM组大鼠心肌中Wnt2、β-catenin的表达均明显增加，其中β-catenin伴随少量核表达。
　　3.奥美沙坦酯对2型糖尿病大鼠心肌SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的干预作用
　　WB实验结果表明，与糖尿病模型组相比较，OLM干预各剂量组心肌组织Wnt2、β-catenin及SIRT1蛋白的表达均显著降低，OLM中剂量降低最显著；DIA组上述蛋白表达变化不大，而OLM联合DIA干预作用与OLM单独作用未见显著性区别。与DM模型组Ang II水平显著升高及AT1-R降低相比较，OLM组能显著降低血清Ang II水平，增加AT1-R蛋白表达；而DIA组Ang II及AT1-R蛋白表达水平无显著变化。
　　结论：
　　1.高脂饮食联合STZ诱导的大鼠DM成模后，随着糖尿病的发生发展，伴随着胰岛素抵抗，心功能有逐渐降低的趋势，心肌细胞凋亡增加，伴随明显的心肌细胞坏死、心肌肥大和心肌纤维化等心肌损伤。
　　2.在DCM的发生发展过程中，随着DM模型大鼠心肌SIRT1表达降低，受其调节的下游因子sFRP2及Dact1表达也降低；而作为Wnt/β-catenin信号通路的特异性抑制剂， sFRP2及Dact1的表达降低导致了Wnt/β-catenin信号通路的激活。
　　3.奥美沙坦酯的干预作用下，SIRT1/Wnt/β-catenin信号通路的激活受到抑制，产生心肌组织保护作用，表明ARB类药物在DCM心肌保护上也具有一定意义，同也时为开发该信号通路的特异性抑制剂提供靶点选择。